葡萄抗白粉病相关基因Mlo的克隆与功能研究

发布时间：2017-05-08 11:21

  本文关键词：葡萄抗白粉病相关基因Mlo的克隆与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前我国葡萄在生产中还存在很多问题,严重影响葡萄产业的发展,尤其是主要栽培种欧洲葡萄,其果实品质优良,但抗病性较差。多年研究表明中国野生华东葡萄白河-35-1(Vitis pseudoreticulata accession.Baihe-35-1)对葡萄白粉菌(Erysiphe necator Schw.[syn.Uncinula necator(Schw.)Burr.])呈高抗性。因此,进一步研究并分离葡萄抗白粉病基因对研究葡萄抗病机理和利用抗病基因改良欧洲葡萄栽培种有重要价值。本研究在课题组已经克隆了抗病的中国野生华东葡萄白河-35-1 VpMlo3、VpMlo6、VpMlo7、VpMlo8、VpMlo11和VpMlo13基因的基础上,进一步克隆了感病的欧洲葡萄佳利酿VvCMlo3、VvCMlo6、VvCMlo7、VvCMlo11、VvCMlo13基因,研究了感抗葡萄中Mlo基因对病原菌的响应模式;分析了5个VpMlo基因的亚细胞定位情况;验证了VpMlo蛋白与CaM蛋白是否互作;鉴定了转VpMlo13基因拟南芥植株对白粉菌的抗性。主要获得以下研究结果:1、从感病的欧洲葡萄佳利酿中克隆了VvCMlo3、VvCMlo6、VvCMlo7、VvCMlo11、VvCMlo13基因,获得的cDNA长度分别为1600bp、1701bp、1690bp、1823bp、1841bp,ORF分别为1329bp、1638bp、1620bp、1752bp、1764bp,分别编码了442、545、539、583、587个氨基酸。2、通过SMART软件分析Mlo蛋白的跨膜结构域,发现VvCMlo3、VvCMlo6蛋白的跨膜结构域分别比华东葡萄VpMLO3、VpMLO6蛋白的跨膜结构域少一个;华东葡萄VpMlo8基因内部提前出现终止子,仅保留了2个跨膜结构域,其余3个Mlo蛋白均由7个跨膜结构域、1个CaMBD结构域和2个保守结构域构成,并且保守性较强。3、通过实时荧光定量PCR分析了感抗葡萄中6个Mlo基因在白粉菌诱导后不同时期的表达量变化,发现在感抗葡萄中Mlo6、Mlo7基因的表达模式相似,均在8h响应剧烈,并且处理组基因的表达量是对照组基因表达量的10倍以上;Mlo11基因在佳利酿葡萄中于8h、72h出现响应,在白河-35-1葡萄中响应不明显;Mlo13基因在白河-35-1葡萄中于8h、7d出现响应,在佳利酿葡萄中响应不明显。总体来说Mlo11、Mlo13基因的表达水平低于Mlo6、Mlo7基因的表达水平。4、分别构建5个VpMlo基因的亚细胞定位载体,通过PEG方法将pBI221-GFP/VpMlo质粒转化到拟南芥原生质体后,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光,发现5个VpMlo基因均定位于细胞膜上。5、从中国野生华东葡萄白河-35-1中克隆了CaM基因,ORF全长为450bp,编码149个氨基酸。分别构建5个VpMlo基因的BD诱饵载体和CaM基因的AD载体,并通过酵母双杂交方法验证了VpMlo蛋白与CaM蛋白是否互作,结果表明VpMlo7蛋白与CaM蛋白互作。6、转VpMlo13基因的三突拟南芥植株经白粉菌处理后,通过台盼蓝染色显微镜观察孢子萌发及菌丝的生长情况,发现转VpMlo13基因的三突拟南芥植株恢复了对白粉菌的敏感性。
【关键词】：华东葡萄白河-35-1 欧洲葡萄佳利酿 Mlo基因 白粉菌 功能验证
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.631.1
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文献综述12-16
• 1.1 植物的免疫抗病机制12-13
• 1.2 Mlo基因的研究进展13-15
• 1.2.1 Mlo基因的概况13-14
• 1.2.2 Mlo基因功能研究14-15
• 1.3 研究目的和意义15-16
• 第二章 材料和方法16-24
• 2.1 试验材料16-17
• 2.1.1 植物材料16
• 2.1.2 质粒载体与菌株16
• 2.1.3 主要试剂16
• 2.1.4 培养基与试剂配制16-17
• 2.2 试验方法17-24
• 2.2.1 葡萄叶片人工接种白粉菌处理与观察17
• 2.2.2 葡萄叶片总RNA的提取及cDNA的合成17
• 2.2.3 欧洲葡萄佳利酿抗白粉病相关基因VvCMlo的克隆17-18
• 2.2.4 欧洲葡萄佳利酿VvCMlo基因在白粉菌诱导后不同时期的表达量分析18-19
• 2.2.5 亚细胞定位19-21
• 2.2.6 酵母双杂交验证21-23
• 2.2.7 转基因拟南芥植株人工接种白粉菌处理与观察23-24
• 第三章 结果与分析24-42
• 3.1 葡萄抗白粉病相关基因Mlo的克隆与序列分析24-29
• 3.1.1 欧洲葡萄佳利酿接种白粉菌后镜检观察24-25
• 3.1.2 欧洲感病葡萄佳利酿抗白粉病相关基因Mlo的克隆25
• 3.1.3 葡萄抗白粉病相关基因Mlo的序列分析25-29
• 3.2 葡萄抗白粉病相关基因Mlo的表达分析29-32
• 3.2.1 白粉菌接种后不同时期内VvCMlo基因表达量的变化29-30
• 3.2.2 VvCMlo基因与VpMLO基因的处理组与对照组相对表达量比值的差异分析30-32
• 3.3 中国野生华东葡萄白河351VpMlo基因的亚细胞定位分析32-35
• 3.4 中国野生华东葡萄白河351VpMlo蛋白与CaM蛋白互作的验证35-40
• 3.4.1 VpMlo基因诱饵表达载体的构建35-37
• 3.4.2 诱饵表达载体自激活验证37
• 3.4.3 CaM基因pGADT7载体的构建37-39
• 3.4.4 中国野生华东葡萄白河351VpMlo蛋白与CaM蛋白互作的验证39-40
• 3.5 转VpMlo13基因拟南芥植株的抗病性分析40-42
• 第四章 讨论42-46
• 4.1 葡萄Mlo基因序列变异42-43
• 4.2 葡萄Mlo基因参与植株抗病反应43-44
• 4.3 中国野生华东葡萄白河351VpMlo蛋白与CaM蛋白相互作用44-45
• 4.4 转VpMlo13基因拟南芥植株的抗病性研究45-46
• 第五章 结论46-48
• 参考文献48-53
• 致谢53-54
• 作者简介54

  本文关键词：葡萄抗白粉病相关基因Mlo的克隆与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：351057