海参i-型溶菌酶基因工程菌的发酵及产品特性分析
发布时间：2021-11-25 16:56
溶菌酶,又称N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶,是一种无害、无毒,不会残留在体内的天然蛋白质。其广泛分布于不同生物体中,是一种能水解微生物细胞壁黏多糖的碱性水解酶。2007年,本实验室首次分离和鉴定了海参i-型溶菌酶基因,并已在原核细胞和真核细胞中高效表达其目的蛋白。该研究以本实验室已构建的能高效表达的海参i-型溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌HS3-1为发酵出发菌株,运用发酵罐对该工程菌进行发酵生产。发酵液经过一系列分离纯化后得到海参i-型溶菌酶产品。利用高效液相色谱和MALDI-TOF质谱技术对海参i-型溶菌酶产品进行分析测定,通过利用分子动力学模拟的方法对该酶热稳定性进一步研究。研究结果如下:（1）5 L发酵罐初始为3 L BSM基础盐培养基,发酵过程控制条件为温度30℃,pH6.0,搅拌转速400 r/min,溶解氧DO 30%;发酵过程分为三个阶段,即细胞生长阶段、甘油流加阶段和甲醇诱导产物分泌阶段。发酵结束后,分析该发酵液的溶菌酶产量为58mg/L。最后生产的海参i-型溶菌酶产品,其酶活力为1246 U/mg。高效液相色谱分析结果显示,该溶菌酶产品与蛋清溶菌酶标准品的出峰时间相同,而且无...
【文章来源】：大连工业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
溶菌酶的催化机制Fig.1-1Thecatalyticmechanismoflysozyme
第三章结果与讨论26图3-2中可以看出，该图为发酵工艺参数控制图，在整个发酵过程中温度和pH随着发酵的进行，一直维持在设定值上下浮动，说明其比较稳定。在细胞生长阶段，因细胞生长繁殖需要进行大量溶解氧，这时可以通过提高通气量和额外补充氧气的方式来维持溶氧。发酵过程中溶解氧的变化是一个十分重要的参数，它的变化可以更加精准控制发酵，从而保障了整个发酵的顺利进行。图3-2发酵工艺参数控制图Fig.3-2Fermentationprocessparametercontrolchart3.1.2发酵过程中菌体量及酶活力检测在发酵初始阶段，测得细胞菌体湿重为61g/L。随着发酵进行到36h，此时细胞菌体积累量达到180-220g/L，细胞积累量达到稳定。接着加入甲醇进行诱导发酵，开始有海参i-型溶菌酶产生。从图3-3可以看出，0-26h为种子液接入发酵罐内细胞菌体大量积累。26-36h溶解氧突升到90%以上，开始对发酵液补充流加甘油培养基，使细胞菌体量进一步积累。36-132h在线监测控制发酵液甲醇浓度1%左右，海参i-型溶菌酶逐渐积累，酶活力最高到达600U/mL。而132h后溶菌酶酶活力不再增加，即发酵结束。
第三章结果与讨论27图3-3酶活力及菌体湿重变化Fig.3-3Thechangesofenzymeactivityandwetcellweight3.1.3不同时期诱导产物的SDS-PAGE分析对上述发酵过程各个时期进行取样，利用SDS-PAGE电泳分析其溶菌酶积累趋势。从图3-4中可以看出，1泳道为诱导0h时，无海参i-型溶菌酶产生；2泳道为诱导12h时，开始产生溶菌酶。随着甲醇诱导时间的迁移，溶菌酶的表达量也随着不断增加，在诱导96h时蛋白表达量达到了最大。进一步将图3-4中目蛋白表达条带使用Bandscan软件进行占比分析，结果显示诱导96h的目的蛋白含量在67.8%。
【参考文献】：
期刊论文
[1]简述溶菌酶的研究现状[J]. 李红,易建中,刘成倩,孙晓云,严华祥. 国外畜牧学(猪与禽). 2016(06)
[2]玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较[J]. 齐建双,王彦玲,铁双贵,卢彩霞,岳润清,韩小花,燕树锋,孙若楠. 华北农学报. 2015(01)
[3]溶菌酶及其在食品工业中的应用[J]. 范林林,林楠,冯叙桥,王晶晶,杨文晶,许泰百. 食品与发酵工业. 2015(03)
[4]热处理对海参溶菌酶C端多肽的抑菌活性和结构的影响[J]. 武瑶,梁雯婧,李成,商旭,丛丽娜. 高等学校化学学报. 2014(05)
[5]溶菌酶在养殖中的应用[J]. 李鑫,谭志坚,凌欣华,李巧贤. 兽医导刊. 2014(04)
[6]溶菌酶在水产品防腐保鲜中的应用[J]. 任西营,胡亚芹,胡庆兰,杨水兵,余海霞,郑刚,杨志坚. 食品工业科技. 2013(08)
[7]蛋清、重组溶菌酶酶学性质及其对小鼠肠道菌群和血清生化指标的影响[J]. 田洪源,刘明启,戴贤君. 中国食品学报. 2012(10)
[8]溶菌酶的分离纯化与活性测定方法的研究进展[J]. 朱莲莲,江明锋,王永. 黑龙江畜牧兽医. 2012(19)
[9]微生物溶菌酶酶学性质及抑菌特性研究[J]. 费国琴,李晓晖,宁喜斌,韩晓晨. 江苏农业科学. 2012(09)
[10]苦瓜溶菌酶的分离纯化及特性研究[J]. 常景立,汪少芸,周建,武柯,李晶,饶平凡. 中国食品学报. 2009(05)
博士论文
[1]天然无规蛋白分子力场的开发及应用[D]. 叶纬.上海交通大学 2015
硕士论文
[1]聚酰亚胺分子动力学模拟及涂膜干燥过程数值计算与优化[D]. 李飞飞.华南理工大学 2017
[2]三氯生类似物对烯脂酰-ACP还原酶（FabI）的作用机制及其抑菌机理研究[D]. 杨旭云.天津理工大学 2016
[3]海参溶菌酶C端多肽异构肽酶的性质研究[D]. 牛庆昌.大连工业大学 2015
[4]FabI抑制剂的分子作用机制及药物设计研究[D]. 艾义新.天津理工大学 2014
[5]溶菌酶抗菌肽的制备、分离与鉴定[D]. 朱伶俐.江南大学 2012
[6]海洋微生物溶菌酶的分离纯化、保存及应用研究[D]. 纪存朋.青岛科技大学 2009
[7]海参肠中溶菌酶分离纯化的工艺研究[D]. 李英辉.大连工业大学 2008
本文编号：3518549
【文章来源】：大连工业大学辽宁省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
溶菌酶的催化机制Fig.1-1Thecatalyticmechanismoflysozyme
第三章结果与讨论26图3-2中可以看出，该图为发酵工艺参数控制图，在整个发酵过程中温度和pH随着发酵的进行，一直维持在设定值上下浮动，说明其比较稳定。在细胞生长阶段，因细胞生长繁殖需要进行大量溶解氧，这时可以通过提高通气量和额外补充氧气的方式来维持溶氧。发酵过程中溶解氧的变化是一个十分重要的参数，它的变化可以更加精准控制发酵，从而保障了整个发酵的顺利进行。图3-2发酵工艺参数控制图Fig.3-2Fermentationprocessparametercontrolchart3.1.2发酵过程中菌体量及酶活力检测在发酵初始阶段，测得细胞菌体湿重为61g/L。随着发酵进行到36h，此时细胞菌体积累量达到180-220g/L，细胞积累量达到稳定。接着加入甲醇进行诱导发酵，开始有海参i-型溶菌酶产生。从图3-3可以看出，0-26h为种子液接入发酵罐内细胞菌体大量积累。26-36h溶解氧突升到90%以上，开始对发酵液补充流加甘油培养基，使细胞菌体量进一步积累。36-132h在线监测控制发酵液甲醇浓度1%左右，海参i-型溶菌酶逐渐积累，酶活力最高到达600U/mL。而132h后溶菌酶酶活力不再增加，即发酵结束。
第三章结果与讨论27图3-3酶活力及菌体湿重变化Fig.3-3Thechangesofenzymeactivityandwetcellweight3.1.3不同时期诱导产物的SDS-PAGE分析对上述发酵过程各个时期进行取样，利用SDS-PAGE电泳分析其溶菌酶积累趋势。从图3-4中可以看出，1泳道为诱导0h时，无海参i-型溶菌酶产生；2泳道为诱导12h时，开始产生溶菌酶。随着甲醇诱导时间的迁移，溶菌酶的表达量也随着不断增加，在诱导96h时蛋白表达量达到了最大。进一步将图3-4中目蛋白表达条带使用Bandscan软件进行占比分析，结果显示诱导96h的目的蛋白含量在67.8%。
【参考文献】：
期刊论文
[1]简述溶菌酶的研究现状[J]. 李红,易建中,刘成倩,孙晓云,严华祥. 国外畜牧学(猪与禽). 2016(06)
[2]玉米叶片2种总蛋白质提取方法的比较[J]. 齐建双,王彦玲,铁双贵,卢彩霞,岳润清,韩小花,燕树锋,孙若楠. 华北农学报. 2015(01)
[3]溶菌酶及其在食品工业中的应用[J]. 范林林,林楠,冯叙桥,王晶晶,杨文晶,许泰百. 食品与发酵工业. 2015(03)
[4]热处理对海参溶菌酶C端多肽的抑菌活性和结构的影响[J]. 武瑶,梁雯婧,李成,商旭,丛丽娜. 高等学校化学学报. 2014(05)
[5]溶菌酶在养殖中的应用[J]. 李鑫,谭志坚,凌欣华,李巧贤. 兽医导刊. 2014(04)
[6]溶菌酶在水产品防腐保鲜中的应用[J]. 任西营,胡亚芹,胡庆兰,杨水兵,余海霞,郑刚,杨志坚. 食品工业科技. 2013(08)
[7]蛋清、重组溶菌酶酶学性质及其对小鼠肠道菌群和血清生化指标的影响[J]. 田洪源,刘明启,戴贤君. 中国食品学报. 2012(10)
[8]溶菌酶的分离纯化与活性测定方法的研究进展[J]. 朱莲莲,江明锋,王永. 黑龙江畜牧兽医. 2012(19)
[9]微生物溶菌酶酶学性质及抑菌特性研究[J]. 费国琴,李晓晖,宁喜斌,韩晓晨. 江苏农业科学. 2012(09)
[10]苦瓜溶菌酶的分离纯化及特性研究[J]. 常景立,汪少芸,周建,武柯,李晶,饶平凡. 中国食品学报. 2009(05)
博士论文
[1]天然无规蛋白分子力场的开发及应用[D]. 叶纬.上海交通大学 2015
硕士论文
[1]聚酰亚胺分子动力学模拟及涂膜干燥过程数值计算与优化[D]. 李飞飞.华南理工大学 2017
[2]三氯生类似物对烯脂酰-ACP还原酶（FabI）的作用机制及其抑菌机理研究[D]. 杨旭云.天津理工大学 2016
[3]海参溶菌酶C端多肽异构肽酶的性质研究[D]. 牛庆昌.大连工业大学 2015
[4]FabI抑制剂的分子作用机制及药物设计研究[D]. 艾义新.天津理工大学 2014
[5]溶菌酶抗菌肽的制备、分离与鉴定[D]. 朱伶俐.江南大学 2012
[6]海洋微生物溶菌酶的分离纯化、保存及应用研究[D]. 纪存朋.青岛科技大学 2009
[7]海参肠中溶菌酶分离纯化的工艺研究[D]. 李英辉.大连工业大学 2008
本文编号：3518549
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