酿酒酵母基因组中影响乙醇发酵的转录因子基因筛选

发布时间：2022-01-05 07:32

　　酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在燃料乙醇的生产中处于重要的地位,但酿酒酵母乙醇发酵背后的基因表达调控机制仍未被完全了解。本研究利用实验室建立的乙醇静态发酵模型,检测了酿酒酵母基因组中的150个转录因子及其转录相关蛋白的单基因缺失株的乙醇产率。筛选出18个（占所有转录因子的10%左右）对酿酒酵母的乙醇发酵产率具有调控功能的转录因子。这些转录因子主要参与细胞周期、染色质重塑、转录、应激反应、蛋白质合成和脂质合成。摇瓶发酵的结果显示,与野生型菌株相比,MBP1,UME6,SWI4,SPT10和SWI6这5个基因的单基因缺失突变菌株在接种后32 h和52 h这两个时间点均显示乙醇产率增加,而SRB8,NGG1,RTF1,RSC1和SWI3这5个基因的单基因缺失突变菌株仅在52 h显示乙醇产率的显著增加;相反,与野生型菌株相比,SEF1,INO2,INO4,RIC1,SPS18,YNR063W,HAC1和HAT1这8个基因的单基因缺失突变菌株在接种后32 h和52 h这两个时间点测得的乙醇产率均显著降低。显示乙醇产率增加的10个单基因缺失突变菌株中,只有RSC1的单... 

【文章来源】：山东理工大学山东省

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

发酵32小时和52小时的乙醇产率

山东理工大学硕士学位论文第四章酿酒酵母缺失突变株的乙醇耐受性26第四章酿酒酵母缺失突变株的乙醇耐受性4.1RSC1的缺失可提高酵母细胞对乙醇的耐受性乙醇产量增长的限制因素之一是酿酒酵母在发酵期间细胞的乙醇耐受水平。因此，本实验检测了发酵过程中显示出乙醇产率增加的11个单基因缺失突变菌株的乙醇耐受性，结果如图4.1所示。首先，对活化的单基因缺失株菌株进行基因型检测。由于实验所用的双倍体单基因缺失株文库的缺失基因是被抗G418的KanMX4遗传标记所替代，因此在各个缺失基因的上下游约200bp设计一对引物Gene-F/Gene-R，在KanMX4标记序列内部设计一对引物Kan-F/Kan-R。以各基因缺失株的基因组DNA为模板，分别用Gene-F/Kan-R和Kan-F/Gene-R进行PCR扩增，验证KanMX4敲除盒是否整合到相应基因的位置上。然后，将基因型验证正确的基因缺失株及野生型菌株BG分别在在YPD和YPD加不同浓度的乙醇平板上进行表现型检测，观察其生长情况。图4.1乙醇耐受性的表型验证。分别在YPD和YPD加不同浓度的乙醇平板上测试野生型菌株BG、ace2/ace2、mbp1/mbp1、swi4/swi4、swi6/swi6、srb8/srb8、swi3/swi3、rsc1/rsc1、rtf1/rtf1,、spt10/spt10,、ngg1/ngg1和ume6/ume6基因突变株的表现型。平板在30℃培养2天。Fig.4.1Ethanoltoleranceassay.EthanoltolerantphenotypesofthewildtypeBG(WT),theace2/ace2,thembp1/mbp1,theswi4/swi4,theswi6/swi6,thesrb8/srb8,theswi3/swi3,thersc1/rsc1,thertf1/rtf1,thespt10/spt10,thengg1/ngg1andtheume6/ume6mutantsonYPDplatesandYPDplatescontainingindicatedconcentrationsofethanol.Plateswereincubatedat30oCfor2days.由图4.1可知，与野生型菌株相比，ACE2的缺失突变菌株显示出较高的乙醇耐受性，而RSC1的

山东理工大学硕士学位论文第五章五升发酵罐的小试实验28第五章五升发酵罐的小试实验5.1发酵培养基的小试实验通过摇瓶实验，共发现10个对乙醇生物合成负调控的转录因子。为进一步探讨这些转录因子基因的单基因缺失菌株在工业发酵应用中的潜在能力，本实验采用与摇瓶发酵一致的控制条件，通过容量为5升的小型发酵罐进行了小试实验。发酵罐中发酵培养基的体积为3.5升，接种量为1%，发酵罐温度设定为30℃。有氧发酵阶段，发酵罐内的搅拌转数设定为220rpm，通气量3L/min。8小时后，调节转速为150rpm，开始低转速发酵。分别于接种后的24小时、48小时和72小时三个时间点取样，检测发酵液中的葡萄糖和乙醇含量。结果如图5.1和图5.2所示。图5.1发酵24h、48h和72h三个时间点的葡萄糖浓度Fig.5.1Glucoseconcentrationatthreetimepointsoffermentationat24h,48hand72h由图5.1可知，与对照野生型菌株相比，除INO2基因的缺失株在三个取样时间点测得的葡萄糖含量与对照野生型菌株相似外，其余单基因缺失株测得的葡萄糖浓度均低于对照野生型菌株。其中，ACE2、SPT10和SWI4基因缺失株在三个取样点的葡萄糖浓度均降低较多，说明这三个基因缺失株可有效提高葡萄糖的利用效率，具有提高乙醇产率的潜力。ACE2基因缺失株在24小时测得的葡萄糖浓度为76g/L，较对照野生型菌株降低了18.3%，在48小时测得的葡萄糖浓度为54g/L，较对照野生型菌株降低了37.2%，在72小时测得的葡萄糖浓度为36.3g/L，较对照野生型菌株降低了54%；SPT10基因缺失株在24小时测得的葡萄糖浓度为80.2g/L，较对照野生型菌株降低了13.8%，在48小时测得的葡萄糖浓度为55.2g/L，较对照野生型菌株降低了35.8%，在72小时测得的葡萄糖浓度为36.8g/L，较对照野生型菌株降低了53.4%；

【参考文献】：
期刊论文
[1]生物传感器法快速测定酒中的乙醇含量[J]. 冯东,王丙莲,梁晓辉,李雪梅,李大海.  酿酒科技. 2012(02)
[2]生物传感器的应用研究进展[J]. 武宝利,张国梅,高春光,双少敏.  中国生物工程杂志. 2004(07)



本文编号：3570020