大白菜遗传转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

发布时间：2022-05-10 19:06

　　大白菜（Brassica rapa L.ssp.Pekinensis）在农作物领域中属于常见的经济型农产品,尤其在中国、日本和韩国等亚洲地区被大面积耕种。随着基因工程技术的发展,农杆菌介导的遗传转化体系和基因编辑技术近年来不断地应用于大白菜育种过程中,加快了大白菜育种进程,同时改良了大白菜性状,为大白菜遗传育种研究奠定了实验基础。本研究建立了稳定高效的大白菜遗传转化体系,并将CRISPR/Cas9系统成功地应用于大白菜基因编辑。（1）试验材料选择大白菜‘C-24’自交系,构建大白菜孤基因BraA1000785超表达载体,通过农杆菌介导法,筛选农杆菌感受态、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度（AS）、外植体侵染时间和超声辅助处理等影响因素。由此建立了大白菜遗传转化体系,转化体系如下:农杆菌感受态:GV3101,菌液OD₆₀₀=0.5,侵染培养基（DM）添加AS浓度为20 mg·L^-1,外植体菌液侵染过程15 min且无需超声处理,共培养培养基（MC）添加AS浓度为20 mg·L^-1（共培养暗处理48h）,外植体在筛选培养基（M... 

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 植物基因工程技术
        1.1.1 植物基因工程技术的研究进展
        1.1.2 植物基因工程技术的应用
    1.2 芸薹属植物离体培养的研究
        1.2.1 芸薹属植物离体再生体系的研究进展
        1.2.2 芸薹属植物离体再生的影响因素
    1.3 农杆菌介导芸薹属植物遗传转化的研究
        1.3.1 农杆菌介导法的转化机理
        1.3.2 影响农杆菌介导芸薹属作物遗传转化的因素
    1.4 基因组编辑技术研究进展
        1.4.1 CRISPR/Cas系统的发现与结构
        1.4.2 CRISPR/Cas9的作用机理
        1.4.3 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用
    1.5 本研究的主要内容
    1.6 本研究的目的及意义
第二章 大白菜遗传转化体系的建立
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 BraA1000785基因克隆
        2.1.3 BraA1000785超表达载体的构建
        2.1.4 大肠杆菌的制备
        2.1.5 农杆菌的制备
        2.1.6 大白菜遗传转化体系的流程
        2.1.7 影响大白菜遗传转化的因素及统计分析
        2.1.8 大白菜转基因植株的检测方法
        2.1.9 大白菜遗传转化体系重复性试验
    2.2 结果与分析
        2.2.1 BraA1000785基因序列分析
        2.2.2 BraA1000785超表达载体的构建
        2.2.3 农杆菌阳性克隆鉴定
        2.2.4 农杆菌菌株对大白菜遗传转化效率的影响
        2.2.5 农杆菌菌液浓度对大白菜遗传转化效率的影响
        2.2.6 乙酰丁香酮浓度对大白菜遗传转化效率的影响
        2.2.7 外植体侵染时间对大白菜遗传转化效率的影响
        2.2.8 超声辅助处理对大白菜遗传转化效率的影响
        2.2.9 大白菜转基因植株的验证
        2.2.10 大白菜遗传转化体系的稳定性
    2.3 讨论
        2.3.1 农杆菌对遗传转化的影响
        2.3.2 酚类物质对遗传转化的影响
        2.3.3 超声辅助处理对遗传转化的影响
        2.3.4 转基因植株的检测
    2.4 小结
第三章 大白菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 菌种及载体
        3.1.3 BraSca000221基因的生物信息学分析及获得
        3.1.4 gRNA的设计
        3.1.5 CRISPR/Cas9载体的构建
        3.1.6 农杆菌介导的遗传转化
        3.1.7 转基因植株的检测
    3.2 结果与分析
        3.2.1 BraSca000221序列分析
        3.2.2 BraSca000221基因的靶点gRNA
        3.2.3 T0代转基因植株的获得
        3.2.4 CRISPR/Cas9编辑效果检测
    3.3 讨论
    3.4 小结
结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]结球甘蓝自交系YL-1的高效遗传转化体系的建立及应用[J]. 崔慧琳,李志远,方智远,杨丽梅,庄木,吕红豪,刘玉梅,宋江华,张扬勇.  园艺学报. 2019(02)
[2]Genome editing in crops: from bench to field[J]. Caixia Gao.  National Science Review. 2015(01)
[3]常见的植物转基因技术及方法研究进展[J]. 徐丽萍,刘树英,于淼,刘洪章.  北方园艺. 2014(20)
[4]大豆子叶节遗传转化受体体系的建立[J]. 曲静,刘思言,姚丹,关淑艳,王丕武,孙佳鑫.  山东农业科学. 2014(05)
[5]基因枪介导的海岛棉（Gossypium barbadense L.）茎尖遗传转化体系的建立[J]. 马玲玲,魏延宏,何兰兰,柴蒙亮,朱华国,孙杰,张薇.  棉花学报. 2014(03)
[6]基因枪介导的大蒜遗传转化体系的建立[J]. 唐巧玲,王旭静,王志兴.  植物遗传资源学报. 2014(03)
[7]PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立[J]. 刘莉,肖招燕,郭丽琼,林俊芳,尤琳烽,廖静文.  菌物学报. 2014(01)
[8]根癌农杆菌介导的芥菜型油菜高效遗传转化[J]. 巩健,张源,杜立国.  四川农业大学学报. 2013(04)
[9]大白菜再生体系和转基因影响因素的研究[J]. 贺玺强,徐恒戬.  黑龙江农业科学. 2013(09)
[10]基因枪介导擎天凤梨遗传转化体系的建立[J]. 沈晓岚,王炜勇,毛碧增,俞少华,田丹青,俞信英.  分子植物育种. 2013(01)

博士论文
[1]草莓CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系建立和FaMAPK12基因功能分析[D]. 邢思年.中国农业大学 2018

硕士论文
[1]水稻基因编辑技术体系建立及深海细菌醛脱氢酶的水稻转化研究[D]. 徐艺源.国家海洋局第三海洋研究所 2017
[2]农杆菌介导的大白菜遗传转化体系的建立[D]. 赵玉竹.沈阳农业大学 2017
[3]大白菜遗传转化体系的优化[D]. 赵静.西北农林科技大学 2016
[4]大白菜离体再生中LBD基因的作用和春化相关BrVIN3基因的遗传转化[D]. 李强.南京农业大学 2015
[5]西兰花再生体系的建立及遗传转化体系初探的研究[D]. 刘煜.东北农业大学 2013
[6]大白菜真叶离体再生体系的研究[D]. 刘学成.西北农林科技大学 2011
[7]大白菜BcDREB1基因的遗传转化研究[D]. 马茜.河北农业大学 2010



本文编号：3652521