基于PGEA的基因载体介导CRISPR/Cas9体内递送在心血管领域的应用研究

发布时间：2022-08-02 17:19

　　CRISPR/Cas9作为一种新兴的基因编辑工具已经被广泛的应用于体内和体外的基因编辑,包括致病基因的纠正、功能基因的验证等。然而由于CRISPR/Cas9的大尺寸,如何安全有效的实现体内递送仍然是限制其进一步发展为人类体内应用的障碍。病毒载体往往受限于其免疫原性和包装能力,非病毒载体由于其灵活性得到越来越多的关注,但是也受到较低的转染效率和较高毒性的制约。虽然多种CRISPR/Cas9系统的递送载体实现在肿瘤疾病中的应用,但是在心血管疾病中的应用微乎其微。普鲁兰糖或者胆固醇功能化的PGEA载体在基因递送方面显示出巨大的潜力。针对以上问题,本论文基于PGEA的基因载体实现有效的CRISPR/Cas9系统递送用于心血管疾病领域。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9（Pcsk9）主要表达在肝脏和小肠组织,是治疗和预防冠心病的重要靶点。目前临床上已经有Pcsk9的单克隆抗体用于冠心病的治疗,但是价格昂贵,需要重复给药。通过CRISPR/Cas9系统实现对Pcsk9的基因编辑同时降低全身给药的副作用将为冠心病的治疗提供一种策略。基于此我们构建了普鲁兰修饰的PGEA（Pul-PGEA）作为C... 

【文章页数】：117 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
    1.1 CRISPR/Cas9系统简介
        1.1.1 CRISPR/Cas9概况
        1.1.2 CRISPR/Cas9作用原理
        1.1.3 CRISPR/Cas9的应用现状
            1.1.3.1 构建疾病动物模型
            1.1.3.2 纠正致病基因
            1.1.3.3 治疗病毒性疾病
    1.2 影响CRISPR/Cas9系统治疗效果的因素
        1.2.1 sgRNA的特异性
        1.2.2 编码方式
        1.2.3 编辑效率
        1.2.4 编辑细胞的适应性
    1.3 CRISPR/Cas9系统的体内递送方式
        1.3.1 病毒载体
        1.3.2 流体动力学注射
        1.3.3 化学载体
    1.4 常见的非病毒基因载体
        1.4.1 阳离子脂质体
        1.4.2 聚合物载体
    1.5 本课题的意义
第二章 普鲁兰糖修饰的PGEA构建高效基因载体递送CRISPR/Cas9系统在心脏疾病中的应用研究
    2.1 基于普鲁兰的纳米系统介导CRISPR/Cas9有效递送用于体内基因编辑
        2.1.1 前言
        2.1.2 实验部分
            2.1.2.1 实验试剂
            2.1.2.2 实验仪器
            2.1.2.3 靶向Pcsk9基因的CRISPR/Cas9系统的设计与构建
            2.1.2.4 靶向Pcsk9基因的CRISPR/Cas9系统的筛选
            2.1.2.5 材料Pul-PGEA的合成
            2.1.2.6 材料Pul-PGEA的表征
            2.1.2.7 纳米颗粒理化性质的表征
            2.1.2.8 生物安全性分析
            2.1.2.9 细胞转染分析
            2.1.2.10 体外基因编辑潜力分析
            2.1.2.12 体内递送效率分析
            2.1.2.13 体内基因编辑分析
            2.1.2.14 体内材料的安全性分析
        2.1.3 结果与讨论
            2.1.3.1 靶向Pcsk9的CRISPR/Cas9系统的设计与筛选
            2.1.3.2 纳米颗粒理化性质表征
            2.1.3.3 材料Pul-PGEA体外生物安全性
            2.1.3.4 材料Pul-PGEA的转染能力分析
            2.1.3.5 材料Pul-PGEA体外介导基因编辑
            2.1.3.6 材料Pul-PGEA体内递送CRISPR/Cas9系统效率
            2.1.3.7 体内基因编辑所产生的生物学效应
            2.1.3.8 材料Pul-PGEA的体内安全性
        2.1.4 本章小结
    2.2 通过Pul-PGEA共递送Cas9 mRNA和sgRNA实现体内肝靶向基因编辑
        2.2.1 前言
        2.2.2 实验部分
            2.2.2.1 实验试剂
            2.2.2.2 实验仪器
            2.2.2.3 靶向Apoc3的CRISPR/Cas9系统的设计与筛选
            2.2.2.4 体外转录Cas9 mRNA和sgRNA
            2.2.2.5 纳米颗粒的表征
            2.2.2.6 细胞毒性分析
            2.2.2.7 材料Pul-PGEA介导小RNA递送分析
            2.2.2.8 材料Pul-PGEA递送长链Cas9 mRNA潜力分析
        2.2.3 结果与讨论
            2.2.3.1 靶向Apoc3的CRISPR/Cas9系统的构建
            2.2.3.2 纳米颗粒的理化性质表征
            2.2.3.3 纳米颗粒的细胞毒性
            2.2.3.4 基因载体Pul-PGEA介导小RNA的细胞吞噬
            2.2.3.5 基因载体Pul-PGEA介导长链Cas9 mRNA递送分析
        2.2.4 本章小结
第三章 富含羟基的纳米系统递送CRISPR/Cas9用于主动脉上的基因编辑
    3.1 引言
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验试剂
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 基因Fbn1特异性CRISPR/Cas9系统的设计与构建与筛选
        3.2.4 理化性质表征
        3.2.5 生物安全性分析
        3.2.6 细胞转染效率分析
        3.2.7 细胞吞噬分析
        3.2.8 内涵体定位分析
        3.2.9 材料CHO-PGEA介导CRISPR/Cas9系统表达分析
        3.2.10 材料CHO-PGEA体外介导CRISPR/Cas9基因编辑所产生的生物学效应
        3.2.11 体内实验
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 基因Fbn1特异性CRISPR/Cas9系统构建与筛选
        3.3.2 纳米颗粒理化性质表征
        3.3.3 生物安全性评价
        3.3.4 材料CHO-PGEA体外递送CRISPR/Cas9系统潜力分析
        3.3.5 材料CHO-PGEA体外介导CRISPR/Cas9系统基因编辑分析
        3.3.6 材料CHO-PGEA体内介导CRISPR/Cas9系统基因编辑分析
        3.3.7 材料CHO-PGEA体内安全性分析
    3.4 本章小结
第四章 全文总结
参考文献
致谢
研究成果及发表的学术论文
作者简介
导师简介
硕士研究生学位论文答辩委员会决议书



本文编号：3668929