甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆与鉴定

发布时间：2017-05-15 09:02

  本文关键词：甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：低温、干旱和盐碱是植物的生长过程中常见的非生物逆境。为了应对这些胁迫,植物在长期的进化过程中形成了一套自我保护的逆境信号传导和应答机制,其中包括细胞内第二信使——Ca2+信号介导的信号传递机制。钙调神经磷酸酶B类似蛋白(Calcineurin B-like protein, CBL)与下游钙调神经磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)相互作用,共同形成了植物应答逆境胁迫的CBL-CIPK信号系统。目前对于CBL-CIPK的研究主要集中在拟南芥和水稻上,在其他植物的研究也相应展开,但在甘蔗中研究甚少。因此,克隆甘蔗CBL-CIPK信号系统中的CBL和CIPK基因并进行初步的功能验证,对解析甘蔗抗逆机制具有较为重要的理论和实践意义。本研究在NCBI数据库和实验室前期转录组测序数据库中,查找和分析获得甘蔗ScCBL和ScCIPK基因相关的EST序列和Unigene序列；然后,利用电子克隆结合RT-PCR (Reversetranscription-PCR)技术,成功获得4个ScCBLs基因和10个ScCIPKs基因序列并对其进行了生物信息学分析；其次,利用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)技术,分析这些基因在甘蔗中的组织特异性表达情况及其在不同外源胁迫下的表达特性；最后,通过双分子荧光互补技术研究了ScCBL2和ScCIPK 15蛋白之间的相互作用。主要研究结果如下：(1)通过电子克隆和RT-PCR扩增,从甘蔗中克隆获得4个ScCBLs和10个ScCIPKs家族基因。生物信息学分析显示,所获得的甘蔗ScCBLs蛋白都含有EF-hands结构域、Ca2+结合位点以及EFh superfamily结构域；ScCIPKs蛋白含有PKc.like superfamily和AMPKA.C-like superfamily,有一个CBL interaction结合位点和一个潜在的PP2C结合位点,这些结果与高粱、水稻同源的CBL和CIPK编码蛋白的氨基酸序列特征高度相似。系统进化分析结果显示,甘蔗CBL蛋白和CIPK蛋白与其他物种的CBL和CIPK蛋白都可以归类到各自的亚族中。(2)组织特异性表达的RT-qPCR分析显示,两个基因家族在甘蔗芽、髓、叶、分生组织和皮中均有表达,其中4个ScCBLs基因在分生组织、蔗芽和蔗髓中均有较高的表达；10个ScCIPKs基因中,ScCIPK4, ScCIPK15、和ScCIPK21在皮中有较高的表达量,ScCIPK5、ScCIPK110、ScCIP14在芽的表达量较高；仅有ScCIPK8在分生组织中有较高的表达量；ScCIPK9、ScCIPK17、ScCIPK28在叶中的表达量较高。(3)不同外源胁迫下基因表达的RT-qPCR分析表明,甘蔗中特定的ScCBL和ScCIPK对非生物胁迫外源因子ABA,盐(NaCl)胁迫、干旱(PEG)胁迫以及氯化钙(CaCl2)胁迫处理有不同的响应模式,且同一处理能够被不同的ScCBL和ScCIPK基因感应,说明不同甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因在应对非生物胁迫逆境中协同发挥作用,同时生物胁迫(接种花叶病毒)中,表现出了不同的表达水平。(4)双分子荧光互补杂交(BIFC)实验发现,甘蔗ScCBL2和ScCIPK 15蛋白之间相互作用,形成CBL-CIPK复合物来解码特异性的Ca2+信号,从而转导胁迫信号。
【关键词】：甘蔗 CBL CIPK RT-PCR 定量荧光PCR 双分子荧光互补杂交 相互作用
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S566.1
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-18
• 1.1 钙离子信号的产生与传递12
• 1.2 Ca~(2+)信号感受器的特征和分类12-14
• 1.2.1 CaM/CML信号系统12-13
• 1.2.2 CDPK信号系统13
• 1.2.3 CBL-CIPK信号系统13-14
• 1.3 CBL-CIPK信号通路研究进展14-16
• 1.3.1 CBL蛋白的结构特征14
• 1.3.2 CIPK蛋白的结构特征14-15
• 1.3.3 CBL-CIPK信号通路的激活及其相互作用15
• 1.3.4 CBL-CIPK信号通路参与植物的逆境响应15-16
• 1.4 本研究的目的及意义16-17
• 1.5 本研究的技术路线图17-18
• 第二章 甘蔗ScCBLs基因家族的分离鉴定和表达分析18-35
• 2.1 实验材料18-19
• 2.1.1 植物材料处理18-19
• 2.1.2 实验试剂19
• 2.2 实验方法19-22
• 2.2.1 甘蔗总RNA提取19
• 2.2.2 cDNA第一条链合成19-20
• 2.2.3 目的基因克隆20-21
• 2.2.3.1 目的基因获得20
• 2.2.3.2 引物设计20-21
• 2.2.3.3 目的基因克隆21
• 2.2.4 目的基因的生物信息学分析21-22
• 2.2.5 目的基因表达分析22
• 2.3 实验结果22-33
• 2.3.1 4个甘蔗ScCBLs基因序列的获得23-25
• 2.3.2 4个甘蔗ScCBLs基因生物信息学分析25-27
• 2.3.2.1 4个甘蔗ScCBLs基因编码蛋白质一级结构预测25-26
• 2.3.2.2 4个甘蔗ScCBLs蛋白二级结果预测与分析26
• 2.3.2.3 4个甘蔗ScCBLs蛋白功能预测26-27
• 2.3.2.4 4个甘蔗ScCBLs蛋白亚细胞定位预测27
• 2.3.3 4个甘蔗ScCBLs蛋白的保守结构域分析27-28
• 2.3.4 4个甘蔗ScCBLs基因编码蛋白的系统进化分析28-31
• 2.3.5 4个甘蔗ScCBLs甘蔗基因的表达分析31-33
• 2.3.5.1 4个ScCBLs基因在甘蔗中的组织特异性表达分析31
• 2.3.5.2 生物胁迫下4个甘蔗ScCBLs基因表达特性31-32
• 2.3.5.3 非生物胁迫下4个甘蔗ScCBLs基因的表达特性32-33
• 2.4 讨论与结论33-35
• 2.4.1 甘蔗ScCBLs的克隆与生物学分析33-34
• 2.4.2 甘蔗ScCBLs组织特异性表达分析34
• 2.4.3 甘蔗ScCBLs对生物胁迫和非生物胁迫的应答34-35
• 第三章 甘蔗ScCIPKs基因家族的分离鉴定和表达分析35-61
• 3.1 实验材料35
• 3.1.1 植物材料处理35
• 3.1.2 实验试剂35
• 3.2 实验方法35-38
• 3.2.1 甘蔗总RNA提取35
• 3.2.2 cDNA第—条链合成35
• 3.2.3 目的基因克隆35-37
• 3.2.3.1 目的基因获得35-36
• 3.2.3.2 引物设计36
• 3.2.3.3 目的基因克隆36-37
• 3.2.4 目的基因的生物信息学分析37
• 3.2.5 目的基因表达分析37-38
• 3.3 实验结果38-58
• 3.3.1 10个甘蔗ScCIPKs基因序列的获得38-45
• 3.3.2 10个甘蔗ScCIPKs基因生物信息学分析45-46
• 3.3.2.1 10个甘蔗ScCIPKs基因编码蛋白质一级结构预测45
• 3.3.2.2 10个甘蔗ScCIPKs蛋白二级结果预测与分析45-46
• 3.3.2.3 10个甘蔗ScCIPKs蛋白功能预测46
• 3.3.2.4 10个甘蔗ScCIPKs蛋白亚细胞定位预测46
• 3.3.3 10个甘蔗ScCIPKs蛋白的氨基酸序列保守结构域分析46-50
• 3.3.4 10个甘蔗ScCIPKs基因编码蛋白的系统进化分析50-53
• 3.3.5 10个甘蔗ScCIPKs基因的表达分析53-58
• 3.3.5.1 10个ScCIPKs基因在甘蔗中组织特异性表达分析53-54
• 3.3.5.2 生物胁迫下10个甘蔗ScCIPKs基因的表达特性54-55
• 3.3.5.3 非生物胁迫下10个甘蔗ScCIPKs基因的表达特性55-58
• 3.4 讨论与结论58-61
• 3.4.1 甘蔗ScCIPKs家族基因的克隆与生物学分析58-59
• 3.4.2 甘蔗ScCIPKs家族基因组织特异性表达分析59
• 3.4.3 甘蔗ScCIPKs基因对生物胁迫和非生物胁迫的应答59-61
• 第四章 甘蔗ScCBL2与ScCIPK15蛋白的互作分析61-68
• 4.1 实验材料61-62
• 4.1.1 植物材料61
• 4.1.2 菌种和质粒61
• 4.1.3 工具酶和试剂盒61-62
• 4.2 实验方法62-63
• 4.2.1 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15互作载体的构建62
• 4.2.2 农杆菌感受态细胞的制备62-63
• 4.2.3 重组质粒转化农杆菌63
• 4.2.4 农杆菌侵染本氏烟及叶片观察63
• 4.3 结果分析63-66
• 4.3.1 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15加接头引物PCR反应的鉴定63-64
• 4.3.2 BP反应重组质粒pDNOR221-X的PCR鉴定64
• 4.3.3 LR反应重组载体质粒鉴定64-65
• 4.3.4 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15的阳性农杆菌转化菌株PCR鉴定65
• 4.3.5 甘蔗ScCBL2和ScCIPK15的BIFC互作结果65-66
• 4.4 讨论与结论66-68
• 第五章 主要结论以及后续研究68-70
• 5.1 主要结论68-69
• 5.2 后续研究69-70
• 参考文献70-78
• 致谢78

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1 黄珑;甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆与鉴定[D];福建农林大学;2016年

  本文关键词：甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆与鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：367307