弓形虫棒状体颈部蛋白5和10基因的免疫保护作用及其基因缺失株的构建

发布时间：2017-05-15 14:06

  本文关键词：弓形虫棒状体颈部蛋白5和10基因的免疫保护作用及其基因缺失株的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可感染几乎所有脊椎动物的专性细胞内寄生原虫,引起弓形虫病。全球约1/3的人受到感染,该病严重危害人类的生命和健康。由于药物治疗无法彻底治愈弓形虫病,因此免疫预防就成为控制该病的首选。但目前为止,尚未有有效、安全的疫苗用来预防人类弓形虫病。棒状体是弓形虫所特有的一种亚细胞器,其分泌的蛋白根据不同部位分为棒状体基部蛋白(rhoptry proteins,ROPs)和棒状体颈部蛋白(rhoptry neck proteins,RONs)。目前,在弓形虫体内已经被证实的RONs有8种,分别为RON1、RON2、RON3、RON4、RON5、RON8、RON9及RON10,研究证明大部分RONs与弓形虫入侵宿主细胞有关。本研究的第一部分首次对12株来自国内外不同宿主与地理来源的弓形虫分离株的棒状体颈部蛋白10(RON10)基因gDNA序列进行PCR扩增、克隆及测序。通过同源性搜索、序列比对分析、构建系统进化发育树,结果表明弓形虫RON10基因在12个不同分离株中序列相对保守,但不是用于对弓形虫进行基因分型的理想的遗传标记分子。由于强弱毒株间变异小,推测RON10基因可能是重要的抗弓形虫疫苗候选抗原。本研究的第二部分分别构建了pVAX-RON5p和pVAX-RON10真核表达质粒,经肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠。三次免疫后测定相应的体液和细胞免疫应答水平,并用弓形虫RH和PRU虫株进行攻虫感染。结果显示,两个实验组小鼠均可诱导机体产生良好的体液和细胞免疫应答,pVAX-RON5p核酸疫苗能够对弓形虫RH株和PRU株产生一定的交叉免疫保护力,而pVAX-RON10核酸疫苗对弓形虫急性和慢性感染均不能产生免疫保护力。因此RON5基因具有一定的免疫原性,可作为候选抗原用于进一步研制实用抗弓形虫疫苗。本研究的第三部分使用CRISPR/Cas9系统分别成功构建了弓形虫RON5和RON10基因的敲除质粒Cas9-sgRON5和Cas9-sgRON10。测序正确后大量提取敲除质粒,与弓形虫RH株速殖子按照一定比例混合,1700 V,130μs,电击两次,将电击后虫体接到Vero细胞中培养。电转染72 h后进行乙胺嘧啶药物筛选,之后收集虫体并计数,将虫体有限稀释后接种预铺Vero细胞的96孔细胞培养板进行弓形虫缺失株的筛选,单克隆进行扩大培养后提取基因组DNA,扩增靶位点小片段测序验证。结果表明,使用常规方法无法直接得到RON5基因的缺失株,而弓形虫△RON10株与RH株相比表型无明显变化。
【关键词】：弓形虫 棒状体颈部蛋白 核酸疫苗 CRISPR/Cas9系统 缺失株
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要3-5
• Summary5-7
• 英文缩写对照表7-10
• 第一章 文献综述10-14
• 1 弓形虫及弓形虫病概述10-11
• 2 弓形虫病疫苗研究进展11-12
• 3 本研究的目的和意义12-14
• 第二章 弓形虫RON10基因序列变异的研究14-25
• 1 材料与方法14-20
• 1.1 材料14-16
• 1.2 方法16-20
• 2 结果与分析20-23
• 2.1 弓形虫RON10基因PCR扩增结果20
• 2.2 弓形虫RON10基因重组菌液PCR扩增结果20
• 2.3 不同虫株之间弓形虫RON10基因序列的变异分析20-23
• 3 讨论23-25
• 第三章 弓形虫p VAX-RON5p、p VAX-RON10 DNA疫苗的制备及免疫效果评价25-59
• 1 材料与方法25-44
• 1.1 材料25-29
• 1.2 方法29-44
• 2 结果与分析44-55
• 2.1 弓形虫RON5p和RON10基因PCR扩增结果44-45
• 2.2 p GEM-RON5p和p GEM-RON10重组质粒的构建结果45-47
• 2.3 p VAX-RON5p和p VAX-RON10真核表达重组质粒双酶切鉴定结果47-48
• 2.4 表达质粒p VAX-RON5p和p VAX-RON10转染Marc-145 细胞的免疫荧光鉴定48
• 2.5 血清中Ig G抗体和Ig G1、Ig G2a抗体亚类的检测48-50
• 2.6 细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 和IL-12（p70）的检测50-52
• 2.7 免疫鼠脾淋巴细胞增殖实验（MTT法）52
• 2.8 流式细胞分选仪分析CD3e~+CD4~+CD8a~-和CD3e~+CD8a~+CD4~-细胞52-54
• 2.9 实验鼠腹腔注射感染弓形虫RH株的效果评价54
• 2.10 实验鼠灌胃感染弓形虫PRU株的效果评价54-55
• 3 讨论55-59
• 第四章 弓形虫RON5、RON10基因敲除质粒的构建及其缺失株筛选59-76
• 1 材料与方法59-68
• 1.1 材料59-61
• 1.2 方法61-68
• 2 结果与分析68-73
• 2.1 Cas9-sg RON5和Cas9-sg RON10敲除质粒的构建结果68-70
• 2.2 RON5和RON10缺失株的筛选及鉴定70-72
• 2.3 噬斑实验72
• 2.4 小鼠毒力实验72-73
• 3 讨论73-76
• 第五章 全文结论76-77
• 参考文献77-88
• 致谢88-89
• 作者简介89-90
• 导师简介90-92

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