日本沼虾免疫应答相关基因的筛选与鉴定
发布时间：2022-10-04 15:00
日本沼虾（Macrobrachium nipponense）是我国淡水虾类养殖业中重要的养殖品种之一,分布广泛。环境胁迫是制约水产养殖业健康发展的重要因素之一,其中氨氮和亚硝酸盐是众多化学污染胁迫因子中最为普遍,也是对机体生理功能影响最为显著的水体胁迫因子。本研究首先对日本沼虾在亚硝酸盐胁迫（10.0 mg/L）和氨氮胁迫（22.1 mg/L）下的免疫指标进行了研究,发现肝胰腺作为主要免疫器官,在日本沼虾抗氨氮和亚硝酸盐胁迫中具有重要作用,且48小时是关键时间点,之后分别进行了转录组实验。在亚硝酸盐胁迫实验中,以亚硝酸盐胁迫和未胁迫48h的日本沼虾的肝胰腺为研究对象,构建3个胁迫和3个未胁迫状态下的肝胰腺转录组文库;在氨氮胁迫实验中,以氨氮胁迫和未胁迫48h的日本沼虾的肝胰腺为研究对象,构建2个胁迫和2个未胁迫状态下的肝胰腺转录组文库。文库分别利用高通量测序平台分析鉴定日本沼虾肝胰腺中与氨氮和亚硝酸盐胁迫相关的差异表达基因,对胁迫下与免疫相关通路进行分析,并对与免疫应答相关的差异表达基因进行分析验证。主要研究结果如下:（1）在浓度为10.0 mg/L亚硝酸盐胁迫下,肝胰腺、血液、肌肉、...
【文章页数】：121 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
英文缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 日本沼虾及养殖现状
1.2 水产养殖中常见环境胁迫因子的来源与危害
1.2.1 氨氮的来源和危害
1.2.1.1 养殖水体中氨氮的来源
1.2.1.2 氨氮对水生动物的危害
1.2.2 亚硝酸盐的来源和危害
1.2.2.1 水产养殖水体中亚硝酸盐的来源
1.2.2.2 亚硝酸盐对水生动物的危害
1.2.3 其他环境因子的来源与危害
1.3 环境因子对甲壳动物免疫系统的影响
1.3.1 氨氮胁迫对甲壳动物免疫系统的影响
1.3.2 亚硝酸盐胁迫对甲壳动物免疫系统的影响
1.3.3 其他环境因子胁迫对甲壳动物免疫系统的影响
1.4 常见体液免疫因子
1.4.1 酚氧化酶
1.4.2 超氧化物歧化酶
1.4.3 总抗氧化能力(T-AOC)
1.5 转录组
1.5.1 转录组学与基因组学概述
1.5.2 转录组技术在水产动物上的应用
1.6 研究的目的与意义
2 材料方法
2.1 试验材料
2.1.1 样品采集
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 试验耗材
2.1.4 主要试剂
2.1.5 常用试剂配制
2.1.6 主要数据库及生物软件
2.2 试验方法
2.2.1 免疫指标测定方法
2.2.1.1 总蛋白定量实验BCA法
2.2.1.2 SOD测定
2.2.1.3 T-AOC测定
2.2.1.4 PO测定
2.2.2 总RNA的提取与检测
2.2.3 转录组测序
2.2.3.1 转录组建库测序流程
2.2.3.2 转录组文库构建
2.2.3.3 转录组文库上机测序
2.2.4 转录组生物信息分析流程
2.2.4.1 测序数据控制及质控
2.2.4.2 转录组测序数据组装
2.2.4.3 转录组基因功能注释和表达水平分析
2.2.5 差异表达mRNAs的qRT-PCR验证
2.2.5.1 反转录合成cDNA
2.2.5.2 差异表达基因引物合成
2.2.5.3 差异表达基因的qRT-PCR
2.2.5.4 荧光定量PCR数据统计与分析
3 结果与分析
3.1 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾免疫指标的影响
3.1.1 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾SOD活性的影响
3.1.2 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾总抗氧化能力的影响
3.1.3 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾PO活性的影响
3.2 氨氮胁迫对日本沼虾免疫指标的影响
3.2.1 氨氮胁迫对日本沼虾SOD活性的影响
3.2.2 氨氮胁迫对日本沼虾总抗氧化能力的影响
3.2.3 氨氮胁迫对日本沼虾PO活性的影响
3.3 亚硝酸盐转录组测序结果
3.3.1 RNA质量检测
3.3.2 原始测序质检情况与测序结果
3.3.3 Trinity拼接结果
3.3.4 基因功能注释
3.3.5 GO分类结果
3.3.6 KOG分类结果
3.3.7 KEGG分类结果
3.3.8 SSR分析
3.3.9 差异表达基因分析
3.3.9.1 差异表达基因聚类分析
3.3.9.2 差异基因GO和KEGG通路富集分析
3.3.10 差异表达mRNAs qRT-PCR验证
3.4 亚硝酸盐胁迫下免疫应答相关差异表达基因的筛选与分析
3.4.1 免疫应答相关差异表达基因的筛选
3.4.2 免疫应答相关差异表达基因的聚类分析
3.4.3 免疫应答相关差异表达基因的KEGG分析
3.4.4 免疫应答相关通路和差异表达基因的验证
3.5 氨氮转录组测序结果
3.5.1 RNA质量检测
3.5.2 转录组序列测定与组装
3.5.3 生物学重复样品间相关性检查
3.5.4 基因功能注释
3.5.5 GO分类结果
3.5.6 SNP和Indel分析
3.5.7 SSR分析
3.5.8 基因表达水平分析
3.5.9 差异基因分析
3.5.9.1 基因差异表达分析
3.5.9.2 差异基因聚类分析
3.5.9.3 差异基因GO富集分析
3.5.9.4 差异基因KEGG通路富集分析
3.5.10 差异表达基因的qRT-PCR验证
3.6 氨氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因筛选与分析
3.6.1 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的筛选
3.6.2 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的聚类分析
3.6.3 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的KEGG分析
3.6.4 免疫应答相关通路和基因的研究
4 讨论
4.1 氨氮和亚硝酸盐对免疫指标的影响
4.2 氨氮胁迫对免疫应答相关基因与通路影响
4.3 亚硝酸盐胁迫对免疫应答相关基因与通路影响
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]中科院海洋所破译海参基因组[J]. 水产科技情报. 2017(06)
[2]氨氮胁迫对中国明对虾血淋巴氨氮、尿素氮含量和抗氧化能力的影响[J]. 王芸,李健,何玉英,段亚飞,张喆,李吉涛. 中国水产科学. 2017(01)
[3]海带粗多糖对斜带石斑鱼血清指标的影响[J]. 李文武,殷光文,林希,黄志坚,林建斌,江和基,朱庆国. 海洋科学. 2015(06)
[4]氨氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌的易感性[J]. 葛红星,李健,陈萍,梁忠秀,任海,李东利. 渔业科学进展. 2014(06)
[5]利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达[J]. 曾地刚,陈秀荔,谢达祥,赵永贞,黎铭,陈晓汉. 南方农业学报. 2013(11)
[6]饲料铜含量对亚硝酸盐胁迫下斑节对虾血细胞的影响[J]. 冼健安,苗玉涛,叶超霞,叶剑敏,郭慧,张胜鹏,王安利. 水生态学杂志. 2013(05)
[7]氨氮对斑节对虾的毒性及免疫指标的影响[J]. 李永,杨其彬,苏天凤,周发林,杨丽诗,黄建华. 上海海洋大学学报. 2012(03)
[8]不同温度条件下氨氮对泥蚶的急性毒性影响[J]. 吕永林,张永普,单赛赛,雷思琦,李凯,金建钰. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2012(01)
[9]亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹幼体相关免疫指标和应激蛋白（HSP70）表达的影响[J]. 洪美玲,陈立侨,孙新谨,李二超,顾顺樟,禹娜. 应用与环境生物学报. 2011(05)
[10]感染白斑综合征病毒的斑节对虾免疫酶变化特征[J]. 王专伟,黄建华,杨其彬,周发林,朱彩艳,杨丽诗,江世贵. 湖北农业科学. 2011(09)
硕士论文
[1]斑节对虾人工选育及氨氮对其免疫、解毒代谢影响[D]. 李永.上海海洋大学 2012
[2]不同浓度氨氮、不同低pH突变对克氏原螯虾免疫功能的影响[D]. 朱毅菲.华中农业大学 2006
[3]环境胁迫对鱼类生理机能影响的初步研究[D]. 洪磊.中国海洋大学 2004
本文编号：3685244
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【学位级别】：博士
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英文缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
1.1 日本沼虾及养殖现状
1.2 水产养殖中常见环境胁迫因子的来源与危害
1.2.1 氨氮的来源和危害
1.2.1.1 养殖水体中氨氮的来源
1.2.1.2 氨氮对水生动物的危害
1.2.2 亚硝酸盐的来源和危害
1.2.2.1 水产养殖水体中亚硝酸盐的来源
1.2.2.2 亚硝酸盐对水生动物的危害
1.2.3 其他环境因子的来源与危害
1.3 环境因子对甲壳动物免疫系统的影响
1.3.1 氨氮胁迫对甲壳动物免疫系统的影响
1.3.2 亚硝酸盐胁迫对甲壳动物免疫系统的影响
1.3.3 其他环境因子胁迫对甲壳动物免疫系统的影响
1.4 常见体液免疫因子
1.4.1 酚氧化酶
1.4.2 超氧化物歧化酶
1.4.3 总抗氧化能力(T-AOC)
1.5 转录组
1.5.1 转录组学与基因组学概述
1.5.2 转录组技术在水产动物上的应用
1.6 研究的目的与意义
2 材料方法
2.1 试验材料
2.1.1 样品采集
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 试验耗材
2.1.4 主要试剂
2.1.5 常用试剂配制
2.1.6 主要数据库及生物软件
2.2 试验方法
2.2.1 免疫指标测定方法
2.2.1.1 总蛋白定量实验BCA法
2.2.1.2 SOD测定
2.2.1.3 T-AOC测定
2.2.1.4 PO测定
2.2.2 总RNA的提取与检测
2.2.3 转录组测序
2.2.3.1 转录组建库测序流程
2.2.3.2 转录组文库构建
2.2.3.3 转录组文库上机测序
2.2.4 转录组生物信息分析流程
2.2.4.1 测序数据控制及质控
2.2.4.2 转录组测序数据组装
2.2.4.3 转录组基因功能注释和表达水平分析
2.2.5 差异表达mRNAs的qRT-PCR验证
2.2.5.1 反转录合成cDNA
2.2.5.2 差异表达基因引物合成
2.2.5.3 差异表达基因的qRT-PCR
2.2.5.4 荧光定量PCR数据统计与分析
3 结果与分析
3.1 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾免疫指标的影响
3.1.1 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾SOD活性的影响
3.1.2 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾总抗氧化能力的影响
3.1.3 亚硝酸盐胁迫对日本沼虾PO活性的影响
3.2 氨氮胁迫对日本沼虾免疫指标的影响
3.2.1 氨氮胁迫对日本沼虾SOD活性的影响
3.2.2 氨氮胁迫对日本沼虾总抗氧化能力的影响
3.2.3 氨氮胁迫对日本沼虾PO活性的影响
3.3 亚硝酸盐转录组测序结果
3.3.1 RNA质量检测
3.3.2 原始测序质检情况与测序结果
3.3.3 Trinity拼接结果
3.3.4 基因功能注释
3.3.5 GO分类结果
3.3.6 KOG分类结果
3.3.7 KEGG分类结果
3.3.8 SSR分析
3.3.9 差异表达基因分析
3.3.9.1 差异表达基因聚类分析
3.3.9.2 差异基因GO和KEGG通路富集分析
3.3.10 差异表达mRNAs qRT-PCR验证
3.4 亚硝酸盐胁迫下免疫应答相关差异表达基因的筛选与分析
3.4.1 免疫应答相关差异表达基因的筛选
3.4.2 免疫应答相关差异表达基因的聚类分析
3.4.3 免疫应答相关差异表达基因的KEGG分析
3.4.4 免疫应答相关通路和差异表达基因的验证
3.5 氨氮转录组测序结果
3.5.1 RNA质量检测
3.5.2 转录组序列测定与组装
3.5.3 生物学重复样品间相关性检查
3.5.4 基因功能注释
3.5.5 GO分类结果
3.5.6 SNP和Indel分析
3.5.7 SSR分析
3.5.8 基因表达水平分析
3.5.9 差异基因分析
3.5.9.1 基因差异表达分析
3.5.9.2 差异基因聚类分析
3.5.9.3 差异基因GO富集分析
3.5.9.4 差异基因KEGG通路富集分析
3.5.10 差异表达基因的qRT-PCR验证
3.6 氨氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因筛选与分析
3.6.1 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的筛选
3.6.2 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的聚类分析
3.6.3 氮胁迫下免疫应答相关差异表达基因的KEGG分析
3.6.4 免疫应答相关通路和基因的研究
4 讨论
4.1 氨氮和亚硝酸盐对免疫指标的影响
4.2 氨氮胁迫对免疫应答相关基因与通路影响
4.3 亚硝酸盐胁迫对免疫应答相关基因与通路影响
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]中科院海洋所破译海参基因组[J]. 水产科技情报. 2017(06)
[2]氨氮胁迫对中国明对虾血淋巴氨氮、尿素氮含量和抗氧化能力的影响[J]. 王芸,李健,何玉英,段亚飞,张喆,李吉涛. 中国水产科学. 2017(01)
[3]海带粗多糖对斜带石斑鱼血清指标的影响[J]. 李文武,殷光文,林希,黄志坚,林建斌,江和基,朱庆国. 海洋科学. 2015(06)
[4]氨氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌的易感性[J]. 葛红星,李健,陈萍,梁忠秀,任海,李东利. 渔业科学进展. 2014(06)
[5]利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达[J]. 曾地刚,陈秀荔,谢达祥,赵永贞,黎铭,陈晓汉. 南方农业学报. 2013(11)
[6]饲料铜含量对亚硝酸盐胁迫下斑节对虾血细胞的影响[J]. 冼健安,苗玉涛,叶超霞,叶剑敏,郭慧,张胜鹏,王安利. 水生态学杂志. 2013(05)
[7]氨氮对斑节对虾的毒性及免疫指标的影响[J]. 李永,杨其彬,苏天凤,周发林,杨丽诗,黄建华. 上海海洋大学学报. 2012(03)
[8]不同温度条件下氨氮对泥蚶的急性毒性影响[J]. 吕永林,张永普,单赛赛,雷思琦,李凯,金建钰. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2012(01)
[9]亚硝酸盐急性胁迫对中华绒螯蟹幼体相关免疫指标和应激蛋白（HSP70）表达的影响[J]. 洪美玲,陈立侨,孙新谨,李二超,顾顺樟,禹娜. 应用与环境生物学报. 2011(05)
[10]感染白斑综合征病毒的斑节对虾免疫酶变化特征[J]. 王专伟,黄建华,杨其彬,周发林,朱彩艳,杨丽诗,江世贵. 湖北农业科学. 2011(09)
硕士论文
[1]斑节对虾人工选育及氨氮对其免疫、解毒代谢影响[D]. 李永.上海海洋大学 2012
[2]不同浓度氨氮、不同低pH突变对克氏原螯虾免疫功能的影响[D]. 朱毅菲.华中农业大学 2006
[3]环境胁迫对鱼类生理机能影响的初步研究[D]. 洪磊.中国海洋大学 2004
本文编号：3685244
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3685244.html
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