用Cre/LoxP和CRISPR基因工程技术构建猪肌肉生长抑制素双等位基因敲除细胞系

发布时间：2022-10-05 22:04

　　肌肉生长抑制素（myostatin,Mstn）基因失活可引起哺乳动物的肌肉增生,但其调控机制尚不清楚,且缺乏可靠的试验材料验证Mstn相关分子通路的变化。本研究所用PK3108细胞系是在野生型PK15细胞系的基础上成功靶向敲除一条等位基因,在其靶位点敲入标记基因,敲除了204bp的外显子3序列,LoxP锚定在其标记基因两侧。利用Cre/LoxP重组酶删除系统删除插入PK3108Mstn靶位点的标记,借助流式细胞仪和荧光蛋白甄别得到无标记的过渡型细胞系PK3108-2。将Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA共转染PK3108-2,借助G418抗性筛选和倒置荧光显微镜挑选出仅带阳性标记的克隆L18,对其基因组进行PCR产物凝胶电泳与PCR产物测序,证明克隆L18在预设位点发生同源重组;对其蛋白质进行Western印迹实验表明,Mstn被成功地敲除失活。综上结果证明,本研究实现了双等位基因的精准敲除,构建了Mstn双敲除梯度回复表达细胞系。本研究为揭示Mstn的作用机制提供理想的实验材料,也为双等位基因的敲除提供了可借鉴的技术路线。 

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 Cas9/sgRNA表达载体和供体DNA的构建
    1.3 PK3108-2和L18细胞系的构建
    1.4 PCR引物设计及反应条件
        1.4.1 PCR引物设计
        1.4.2 PCR条件
    1.5 Western印迹
2 结果
    2.1 Cas9/sgRNA和p Turbo-Cre及供体DNA载体的鉴定
    2.2 L18发生同源重组基因组左右结合部序列分析
    2.3 PK3108-2与L18的荧光标记鉴定
    2.4 Mstn不同基因型的凝胶电泳及Western印迹
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建猪肌抑素基因敲除细胞系[J]. 綦世金,华再东,刘西梅,华文君,郑新民,陈祥,李太山,陈建武,李奎,唐中林,毕延震,陈彬.  中国生物化学与分子生物学报. 2016(10)
[2]Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价[J]. 王志蕊,刘西梅,周荆荣,郑新民,魏庆信,董发明,毕延震.  中国生物化学与分子生物学报. 2014(02)
[3]肌肉生长抑制素（MSTN）的研究进展[J]. 耿红红,王政.  畜牧与饲料科学. 2012(09)
[4]水通道蛋白5基因敲除纯合子小鼠的获取[J]. 王桂芳,董春玲,肖奎,孙加源,陈智鸿,白春学.  第二军医大学学报. 2007(11)



本文编号：3686588