CRISPR-Cas9介导的人原代T细胞的基因编辑

发布时间：2022-11-09 22:04

　　目的:CRISPR-Cas9自从2012年被研究开发利用以来,已被应于多种领域,包括各种生物体的基因组编辑或者基因表达调控。与此同时,过继性免疫治疗也在治疗肿瘤的试验中取得了令人满意的效果,人们正在努力通过对T细胞的基因编辑,开发以嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR）T为代表的更有效的T细胞,以提高其反应率和耐久性。而以CTLA-4、PD-1为代表的免疫检查点分子被发现能够作为免疫细胞上的抑制性受体,与对应的配体结合,并导致T细胞衰竭,成为细胞免疫治疗的障碍。因此,本文利用CRISPR-Cas9技术和一系列针对检查点基因的sgRNA质粒,尝试在原代T细胞中永久地沉默这些检查点基因;并尝试结合CD133 CAR,探索当将检查点阻断与CAR联合使用时会对T细胞产生怎样的功能性影响。方法:我们设计并制备了包括靶向CTLA-4、TIM-3、2B4、LAG-3等sgRNA,与Cas9共转染HeLa细胞系后对靶向区域进行T7EN1检测和T-A克隆测序,筛选出效率最高的sgRNA。通过分子克隆将高效靶向PD-1与TIM-3的sgRNA制作成多个U6启动子串联的sgR... 

【文章页数】：83 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

PD-1,CTLA-4/CD28与其配体相互作用示意图

CTLA-4sgRNA细助系脸证田(a)所选4个sEttNA的nm海切效果图，以及将3与a纽合在一起时的切割效果

PD-1与TIM-3联合sgRN^细胞系验证图


本文编号：3704976