烟草维管束发育相关基因sm-Nvas的敲除及原核表达

发布时间：2022-12-25 17:55

　　维管植物的维管束（vascular bundle）是植物体最主要的输导组织,其形成与发育是一个受多种基因和调控途径共同作用的生化过程。本实验室从烟草中克隆了一个在维管束中特异表达的新基因sm-Nvas。为了初步分析其功能,利用CaMV35S为启动子,与sm-Nvas全基因序列和GUS相连接形成融合基因,构建了表达载体CaMV35S::sm-Nvas::GUS,并遗传转化,获得转基因阳性植株,表现出矮化、茎和叶脉增粗、维管束列数增多、维管束薄壁细胞的长度缩短等特征。因此,初步认为sm-Nvas与维管束发育相关。本实验完成的主要内容包括以下两个方面:（1）在此基础上,为了进一步探讨该基因的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对烟草维管束发育相关基因sm-Nvas中的两段序列进行敲除,并成功构建了pc1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除载体,将构建好的敲除载体电激转化农杆菌并侵染烟草叶盘,完成遗传转化和转基因植株的阳性鉴定及基因编辑分析,对阳性植株和野生型植株进行对比观察,进一步确定该基因在维管束生长发育过程中所起到的作用。（2）本研究还构建了pMAL-p5x-sm... 

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 维管束及其发育调控
        1.1.1 维管束简介
        1.1.2 维管束的发育调控
    1.2 基因编辑技术的发展与应用
        1.2.1 基因编辑技术的发展
        1.2.2 CRISPR基因编辑系统的结构和作用
        1.2.3 CRISPR基因编辑系统的应用
    1.3 pMAL原核表达载体的功能与应用
    1.4 本研究的目的及意义
第二章 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除载体的构建及遗传转化
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 烟草品种
        2.2.2 菌株及载体
        2.2.3 主要试剂及配方
        2.2.4 主要仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除载体的构建
        2.3.2 阳性克隆电激转化农杆菌
        2.3.3 农杆菌介导的pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas烟草遗传转化
        2.3.4 转基因T0代植株的阳性鉴定
        2.3.5 转基因T0代植株的表型分析及切片观察
    2.4 结果与分析
        2.4.1 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除载体的构建
        2.4.2 pC1300-Cas9-gRNA-sm-Nvas敲除载体的遗传转化
        2.4.3 转基因苗的阳性鉴定
        2.4.4 转基因苗的基因敲除检测
        2.4.5 转基因T0代植株的表型分析与切片观察
    2.5 讨论
第三章 sm-Nvas原核表达载体构建及其蛋白纯化
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 烟草品种
        3.2.2 载体及菌株
        3.2.3 主要试剂及配方
        3.2.4 主要仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表达载体的构建
        3.3.2 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表达载体的诱导表达
    3.4 结果与分析
        3.4.1 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表达载体的构建
        3.4.2 pMAL-p5x-sm-Nvas原核表达载体的诱导表达
        3.4.3 表达蛋白纯化
    3.5 讨论
参考文献
致谢
参与的学术会议


【参考文献】：
期刊论文
[1]稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建[J]. 刘早利,陈亚红,王春台,刘新琼.  中国农学通报. 2016(06)
[2]CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J]. 解莉楠,宋凤艳,张旸.  中国农业科学. 2015(09)
[3]重组MBP-GnRH6融合蛋白的表达与鉴定[J]. 王索路,方富贵,刘亚,章孝荣,李运生,张运海,陶勇,曹鸿国.  农业生物技术学报. 2010(02)
[4]HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达[J]. 刘照惠,邵丽军,金立杰,李利.  生物技术. 2006(03)
[5]人胰岛素原C肽基因高效表达载体的构建[J]. 于祥,秦文浩.  南通大学学报(医学版). 2005(01)

硕士论文
[1]水稻ORF216蛋白和烟草SM-NGT1蛋白的原核表达研究[D]. 胡婧.中南民族大学 2010



本文编号：3727082