枯草芽孢杆菌中终止子和5’非编码区对外源基因表达的影响

发布时间：2023-01-03 10:12

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种重要的革兰氏阳性菌,多年来一直作为模式微生物使用。随着全基因组测序的完成、转录组学和蛋白组学等多组学分析的不断深入,B.subtilis已经成为代谢工程、重组蛋白表达和复杂遗传线路等研究的理想底盘微生物。目前在枯草芽孢杆菌中利用合成生物学构建表达模块已成为研究热点。人工基因表达元件是设计表达模块、构建基因电路的基础。目前,在枯草芽孢杆菌中已有多种不同类型的人工启动子广泛应用到基因电路中,而诸多其他类型的元件,如存在于非编码区的终止子和调控序列等尚未充分挖掘、开发,且元件在枯草芽孢杆菌中对外源基因的调控规律尚缺乏系统研究。这些问题阻碍了构建大规模复杂调控网络的发展,极大制约了枯草芽孢杆菌合成生物技术的推进。基于此,本论文分别研究了存在于枯草芽孢杆菌中3’非编码区的终止子和5’非编码区的调控序列对异源基因表达的作用,并且通过合成生物学技术对这两种调控序列进行改造,提升了外源基因的表达效率,研究取得的具体研究结果如下:（1）B.subtilis中高效终止子的鉴定及分子改造。以GFP和mCherry为报告基因,构建了基于双荧光信号的终止... 

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 合成生物学在枯草芽孢杆菌中研究进展
        1.1.1 合成生物学概述
        1.1.2 枯草芽孢杆菌表达系统
        1.1.3 影响枯草芽孢杆菌中蛋白表达的因素分析
    1.2 原核生物表达的调控元件
        1.2.1 启动子
        1.2.2 核糖体结合位点
        1.2.3 终止子——3’非编码区RNA调控元件
        1.2.4 调控RNA元件——5’非编码区调控元件
        1.2.5 影响mRNA稳定性的5’-UTR特征
        1.2.6 RNA调控元件在基因表达调节中的优势
    1.3 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的概述及应用
        1.3.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的简介
        1.3.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶的应用
    1.4 课题研究的意义与内容
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 培养基
        2.1.5 主要溶液
    2.2 DNA操作
        2.2.1 质粒的提取
        2.2.2 引物的设计
        2.2.3 基因扩增
        2.2.4 DNA的检测和回收
        2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化
        2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态制备与转化
    2.3 终止子重组质粒的构建
        2.3.1 终止子测试质粒的构建
        2.3.2 单终止子的构建
        2.3.3 双串联终止子的构建
        2.3.4 三串联终止子的构建
    2.4 L-天冬氨酸-α-脱羧酶重组表达质粒的构建
        2.4.1 L-天冬氨酸-α-脱羧酶表达质粒的构建
        2.4.2 L-天冬氨酸-α-脱羧酶C末端融合sfGFP质粒的构建
        2.4.3 L-天冬氨酸-α-脱羧酶N末端融合sfGFP质粒的构建
        2.4.4 N端截短突变体的构建
        2.4.5 融合肽精简突变体的构建
    2.5 分析方法
        2.5.1 绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry荧光水平的检测
        2.5.2 终止效率的测定方法
        2.5.3 重组蛋白表达水平的检测
        2.5.4 PanD酶活水平的检测
        2.5.5 荧光定量PCR
        2.5.6 统计分析
第三章 结果与讨论
    3.1 终止子在枯草芽孢杆菌中对异源基因表达的调控及分子改造
        3.1.1 终止子筛选平台的建立
        3.1.2 终止子终止效率的鉴定
        3.1.3 终止子TB5 与大肠杆菌标准化强终止子rrnBT1 性能比较
        3.1.4 串联终止子的构建及表征
    3.2 mRNA5’非编码区对异源蛋白表达的抑制机制和消除策略
        3.2.1 赤拟谷盗L-天冬氨酸-α-脱羧酶在B.subtilis中表达抑制效应的鉴定
        3.2.2 panD基因mRNA5’端二级结构对重组蛋白表达水平的调控作用
        3.2.3 利用N端融合策略消除PanD翻译抑制
        3.2.4 融合肽长度精简及筛选
        3.2.5 PanD不同融合形式及突变体基因转录水平的检测
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]β-丙氨酸的生理功能及其在动物生产中的应用[J]. 齐博,武书庚,王晶,齐广海,张海军.  动物营养学报. 2016(04)
[2]β-氨基丙酸的合成与应用[J]. 罗积杏,薛建萍,沈寅初.  氨基酸和生物资源. 2005(01)
[3]苯基异硫氰酸酯衍生氨基酸的高效液相色谱分析[J]. 杨扬，秦强，郭伟忠.  色谱. 1994(04)



本文编号：3727273