草鱼Bcl-xl基因的转录调控及抗凋亡功能分析

发布时间：2023-02-06 18:10

　　众所周知,Bcl-xl,Bax2和NF-κB参与抗凋亡反应。尽管在一些鱼中已经报道了Bcl-xl,但NF-κB介导的调节机制和细胞抗凋亡功能仍不清楚。本实验我们克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idella)Bcl-xl(CiBcl-xl)的全长cDNA序列及其启动子序列。CiBcl-xl的全长cDNA为2836bp,ORF为627bp,编码208个氨基酸的多肽。系统进化树分析显示CiBcl-xl与Dario rerio Bcl-xl(Dr Bcl-xl)具有高度同源性。在用poly I:C刺激后,CIK细胞和各组织中CiBcl-xl的表达显著上调,这说明CiBcl-xl在抗病毒免疫机制中有重要作用。之后为了进一步理解NF-κB对Bcl-xl的转录调控,在大肠杆菌BL21中大量表达CiC-rel和Cip65,并通过Ni-NTA His-Bind树脂的亲和层析纯化。在体外,凝胶阻滞实验分析证明了CiC-rel和Cip65与CiBcl-xl启动子的高亲和力。双荧光素酶报告基因检测显示CiC-rel和Cip65都能激活CiBcl-xl启动子。因此,与哺乳动物类似,鱼类C-rel和...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 Bcl-2 家族
    1.2 Bcl-xl的结构及其功能
    1.3 Bcl-xl信号传导通路
        1.3.1 Bcl-xl转录水平
        1.3.2 Bcl-xl蛋白水平
    1.4 Bcl-xl的研究进展
    1.5 研究的目的与意义
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株、载体与菌种
        2.1.2 实验仪器设备
        2.1.3 主要试剂和试剂盒
        2.1.4 引物表
        2.1.5 相关软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 草鱼Bcl-xl全长c DNA的克隆
        2.2.2 草鱼Bcl-xl启动子的克隆
        2.2.3 草鱼Bcl-xl的系统进化分析
    2.3 草鱼Bcl-xl在 CIK细胞中与组织中的表达水平分析
        2.3.1 草鱼Bcl-xl在组织中的表达分析
        2.3.2 草鱼Bcl-xl在 CIK细胞中的表达分析
    2.4 草鱼C-rel、p65 原核表达载体构建及蛋白纯化
        2.4.1 原核表达载体
        2.4.2 小量诱导
        2.4.3 大量表达及蛋白纯化
    2.5 草鱼Bcl-xl真核表达载体构建
    2.6 草鱼C-rel、p65与Bcl-xl启动子序列的亲和性分析
    2.7 细胞转染及双荧光素酶分析
        2.7.1 细胞转染
        2.7.2 荧光素酶活性检测
    2.8 草鱼肾细胞(CIK)C-rel、p65 的敲降(knock-down)
        2.8.1 Ci C-rel、Cip65的siRNA设计
        2.8.2 siRNA片段转染CIK细胞
        2.8.3 草鱼C-rel、p65 敲降后Bcl-xl的转录水平检测
    2.9 细胞活力和细胞凋亡检测
        2.9.1 细胞活力测定
        2.9.2 细胞凋亡检测
    2.10 GST-pull down实验
第三章 结果与分析
    3.1 草鱼Bcl-xl的克隆及其分析
        3.1.1 草鱼Bcl-xl全长c DNA的克隆
        3.1.2 草鱼Bcl-xl基因测序结果分析
        3.1.3 草鱼Bcl-xl基因的系统进化分析
    3.2 草鱼Bcl-xl启动子的克隆及其分析
    3.3 草鱼Bcl-xl基因的定量表达分析
    3.4 草鱼C-rel、p65与Bcl-xl的启动子亲和性分析
    3.5 草鱼Bcl-xl的转录调控分析
        3.5.1 检测草鱼Bcl-xl启动子活性
        3.5.2 草鱼C-rel、p65对Bcl-xl基因的转录调控分析
    3.6 草鱼C-rel、p65 敲降后Bcl-xl的转录表达分析
    3.7 过表达Ci Bcl-xl能增加细胞活力并抑制细胞凋亡
    3.8 Ci Bcl-xl-FLAG标签的检测及Ci Bcl-xl和 Ci Bax2 的相互作用
第四章 讨论
致谢
参考文献
攻读学位期间发表论文



本文编号：3736372