利用Redundant Exclusion PCR方法鉴定、克隆Bt新型杀虫基因

发布时间：2017-05-19 16:03

  本文关键词：利用Redundant Exclusion PCR方法鉴定、克隆Bt新型杀虫基因，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)对农业害虫具有特异性的杀虫活性,是目前害虫生物防治中最有效的微生物杀虫剂之一。因此,对Bt菌株中的基因资源鉴定克隆具有重要的意义。为了解决鉴定克隆Bt菌株基因资源传统研究方法中的速度慢,效率低下的问题,本研究建立了redundant exclusion PCR(RE-PCR)方法,该方法是在PCR同一反应体系中同时加入通用引物与特异性引物,以基因组池为模板进行新基因的克隆。在RE-RCR过程中,通用引物可扩增目标基因,特异引物可抑制非靶标冗余基因扩增,以提高新基因的发掘效率。本研究利用2000株Bt野生菌株基因组构建了Bt基因组池,对Bt基因组池中的cry8及cry9类新基因进行鉴定克隆。在Bt基因组池中含有许多已知的杀虫基因,为了排除非靶标冗余基因对新基因克隆的干扰,首先使用通用引物对Bt基因组池中的cry8及cry9类基因分布进行评估,结果发现,构建的基因文库中已知基因比例占95%以上,其中以cry9Ea、cry9Da基因比例较高,新基因cry8-like(accession:KU143733)克隆比例为4.5%;进一步设计cry9Ea/b和cry9Da基因特异引物RE9Ea/b_F和RE9Da_F,利用redundant exclusion PCR方法构建的基因文库中未检测到cry9Da及cry9Eb基因,cry9Ea基因的克隆比例下降到7%,非靶标基因的克隆比例明显降低,新增了三种已知基因(cry8Ab-like、cry8Ea、cry8Fa)的酶切带型,新基因cry8-like的克隆比例提高到42.5%,证明该方法能够有效的抑制冗余基因的扩增,显著提高稀有新基因的克隆效率。新基因cry8-like与Cry8Ab相似性为79%,将该基因与cry8Ea基因的C-端序列融合并克隆到p STK载体上,转化到无晶体突变菌株HD73-中,获得重组菌株HD8。扫描电子显微镜观察及SDS-PAGE分析表明:重组菌株能产生球形晶体,并表达130 k Da左右的目的蛋白,经胰凝乳蛋白酶消化后可获得60 k Da左右的蛋白。测定消化后Hycry8蛋白对大猿叶甲及HD8孢晶混合物对铜绿丽金龟、大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟幼虫的生物活性显示,HD8孢晶混合物的芽胞含量在1012 CFU/g·土时对铜绿丽金龟幼虫具有一定的杀虫活性,校正死亡率为44%。综上所述,本研究建立的RE-PCR可高通量快速、高效的对Bt菌株中的基因资源进行鉴定及克隆,有效的提高了新基因的鉴定及克隆效率,对进一步杀虫基因鉴定与克隆研究有重要的意义。
【关键词】：苏云金芽胞杆菌 基因组池 redundant exclusion PCR 基因克隆 生物活性
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S476
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-26
• 1.1 苏云金芽胞杆菌概述10-11
• 1.2 Bt毒素的命名与分类11-12
• 1.3 杀虫晶体蛋白及其作用机理12-17
• 1.3.1 Cry毒素12-16
• 1.3.2 Cyt毒素16-17
• 1.4 苏云金芽胞杆菌的应用17-18
• 1.4.1 Bt生物杀虫剂17-18
• 1.4.2 Bt转基因抗虫植物18
• 1.5 Bt杀虫基因鉴定方法18-23
• 1.5.1 多重PCR19
• 1.5.2 Exclusive PCR19-20
• 1.5.3 PCR-Restriction fragment length polymorphism20-21
• 1.5.4 PCR-High resolution melting21-22
• 1.5.5 PCR-High throughput sequencing22-23
• 1.5.6 宏基因组-PCR23
• 1.6 研究目的及意义23-26
• 第二章 Redundant Exclusion PCR方法的建立及新基因克隆26-46
• 2.1 实验材料26
• 2.2 实验方法26-38
• 2.2.1 PCR通用引物设计26-29
• 2.2.2 Bt基因组池的构建29-30
• 2.2.3 Bt基因组池中cry8及cry9类基因鉴定30-33
• 2.2.4 Redundant Exclusion引物设计33-37
• 2.2.5 Redundant Exclusion引物评估37-38
• 2.2.6 Redundant Exclusion PCR38
• 2.2.7 Redundant Exclusion PCR产物中cry8和cry9类基因型鉴定38
• 2.2.8 新基因序列分析38
• 2.3 结果38-44
• 2.3.1 Bt基因组池的构建38-39
• 2.3.2 Bt基因组池中cry8及cry9类基因鉴定39-42
• 2.3.3 Redundant Exclusion引物评估42-43
• 2.3.4 Redundant Exclusion PCR43-44
• 2.3.5 新基因序列分析44
• 2.4 小结44-46
• 第三章 cry8-like基因表达及活性分析46-58
• 3.1 实验材料46-47
• 3.1.1 菌株与质粒46
• 3.1.2 供试昆虫46-47
• 3.2 实验方法47-52
• 3.2.1 新基因在Bt无晶体突变株中的表达47-51
• 3.2.2 Hycry8蛋白消化51
• 3.2.3 蛋白二级质谱鉴定51
• 3.2.4 生物活性测定51-52
• 3.3 结果52-57
• 3.3.1 cry8-like基因在Bt无晶体突变菌株中的表达52-54
• 3.3.2 二级蛋白质谱鉴定54-55
• 3.3.3 生物活性分析55-57
• 3.4 小结57-58
• 第四章 讨论58-60
• 第五章 结论60-62
• 参考文献62-72
• 致谢72-74
• 附录74-78
• 作者简历78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈桂花;束长龙;李颖;宋福平;郭媛媛;李国勋;张杰;;基于聚合酶链式反应-高通量测序(PCR-HTS)联用的cry2A基因鉴定方法[J];中国生物防治学报;2014年05期

2 刘旭光,宋福平,文思远,王升启,黄大f ,张杰;苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究[J];中国农业科学;2004年07期

3 喻子牛;孙明;刘子铎;戴经元;陈亚华;喻凌;罗曦霞;;苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性蛋白基因[J];中国生物防治;1996年02期

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本文编号：379119