奶牛乳房炎大肠杆菌lps基因亚单位疫苗的构建及免疫原性研究

发布时间：2017-05-20 12:15

  本文关键词：奶牛乳房炎大肠杆菌lps基因亚单位疫苗的构建及免疫原性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乳腺炎是由物理因素、化学因素和生物因素等引起的乳腺实质性炎症。奶牛乳腺炎的致病原在自然环境中广泛存在,包括细菌性和非细菌性病原体,如:支原体、真菌、酵母和衣原体等。据报道,大肠杆菌是一种条件性致病菌,是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一。近年来,大肠杆菌引发的奶牛乳腺炎多有报道,针对大肠杆菌性乳腺炎的研究也日益增多。大肠杆菌携带大量的毒力因子和耐药性基因。脂多糖是大肠杆菌细胞壁的重要组成部分,包括类脂A、核心多糖和特异性多糖,是革兰氏阴性菌最重要的毒力因子。鉴于此,本研究从实验室保存的野生型大肠杆菌中克隆出与核心多糖抗原合成相关的基因—lps基因。在T4 DNA连接酶的诱导下,构建pcDNA3.1-His-lps重组真核表达载体。采用脂质体2000介导的方法,将该重组表达载体转染乳腺癌细胞(MCF-7)。通过荧光定量检测lps基因在mRNA水平的表达情况,并通过Western blot(WB)检测蛋白水平的表达情况。为了检验lps基因表达蛋白的免疫原性,将纯化过的脂多糖蛋白通过皮下注射和滴鼻的方式免疫BALB/C小鼠。14d为一个免疫周期,三免之后的第10d,采取小鼠的血液、呼吸道粘液和肺脏研磨液,选择大肠杆菌强毒株攻毒免疫小鼠,检测LPS对小鼠的免疫保护情况。采取小鼠的血液、呼吸道粘液和肺脏研磨液,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、呼吸道粘液和肺脏研磨液中IgG抗体和sIgA抗体的效价;通过间接ELISA检测血清、呼吸道粘液和肺脏研磨液中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ细胞因子的表达水平。结果如下:1.从野生型大肠杆菌中克隆出1282bp基因片段,成功构建出pcDNA3.1-lps真核表达载体。2.成功将pcDNA3.1-lps真核表达载体转染MCF-7乳腺癌细胞,经过新霉素G418筛选得到阳性细胞株。提取阳性细胞株的总蛋白,经Western blot鉴定,在42KDa出现一条特异性条带,与预测蛋白大小一致。3.经ELISA鉴定,脂多糖蛋白免疫小鼠的血清中IgG的效价高达1:12800,皮下注射组和滴鼻组之间无明显差异(P0.05),质粒免疫组的效价为1:3200。SIgA的抗体效价在蛋白免疫组高达1:6400,不同蛋白量免疫组织间差异不显著(P0.05),质粒免疫组的效价为1:1600。IL-2和IFN-γ的表达水平在蛋白免疫组与质粒免疫组差异极显著(P0.01),与PBS对照组的差异极显著(P0.01);IL-4的表达水平在LPS蛋白免疫组与质粒免疫组差异性显著(P0.05),与PBS对照组的差异极显著(P0.01)。IL-6的表达水平在各组之间无明显差异(P0.05)。4动物免疫保护实验表明,蛋白免疫组的保护率为60%-70%,质粒免疫组的保护率为20%-30%,PBS对照组的保护率为0。本研究成功获得奶牛乳房炎大肠杆菌lps基因亚单位疫苗,其具有较好的免疫保护率,这为奶牛乳房炎的预防和治疗奠定理论基础。
【关键词】：奶牛 乳房炎 大肠杆菌 lps 重组载体 免疫 抗体 细胞因子
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 缩略词对照表4-6
• 摘要6-8
• Summary8-12
• 第一章 文献综述12-26
• 1 奶牛乳房炎概述12
• 2 乳房炎的病因学12-13
• 2.1 病原因素13
• 2.2 环境因素13
• 2.3 自身因素13
• 3 乳房炎的免疫机制13-15
• 3.1 先天性免疫机制13-14
• 3.2 体液免疫机制14
• 3.3 细胞免疫机制14-15
• 4 大肠杆菌乳房炎概述15-19
• 4.1 大肠杆菌的生物学特性15
• 4.2 大肠杆菌的致病性15-17
• 4.3 大肠杆菌乳房炎的危害17-19
• 5 大肠杆菌乳房炎的预防19-20
• 5.1 加强管理19
• 5.2 规范挤奶操作19
• 5.3 加强对乳房炎的检测19-20
• 5.4 改善农场的环境卫生20
• 5.5 疫苗预防20
• 6 大肠杆菌乳房炎的治疗20-23
• 6.1 抗生素治疗20-21
• 6.2 噬菌体疗法21
• 6.3 疫苗21-22
• 6.4 纳米粒子22
• 6.5 细胞因子22
• 6.6 抗菌剂22-23
• 7 大肠杆菌性乳房炎疫苗的研究进展23-24
• 7.1 灭活疫苗23
• 7.2 大肠杆菌苗23-24
• 7.3 DNA疫苗24
• 7.4 基因缺失疫苗24
• 7.5 亚单位疫苗24
• 8 大肠杆菌脂多糖24-26
• 第二章 大肠杆菌pc DNA3.1-His-lps重组真核表达载体的构建与鉴定26-35
• 1 材料与方法26-31
• 1.1 试验材料26-27
• 1.2 试验方法27-31
• 2 结果31-33
• 2.1 大肠杆菌lps的克隆与鉴定31-32
• 2.2 重组载体T-easy-lps的鉴定32
• 2.3 重组载体的鉴定32-33
• 3 讨论33-35
• 第三章 重组真核表达载体pc DNA3.1-His-lps在乳腺癌细胞中的表达与鉴定35-46
• 1 材料与方法35-41
• 1.1 试验材料35-36
• 1.2 试验方法36-41
• 2 结果41-45
• 2.1 转染41-42
• 2.2 反转录鉴定42-43
• 2.3 荧光定量检测在m RNA水平的表达情况43-44
• 2.4 Western blot检测在蛋白水平的表达情况44-45
• 3 讨论45-46
• 第四章 Lps基因亚单位疫苗的免疫原性研究46-59
• 1 材料与方法46-51
• 1.1 试验材料46-47
• 1.2 试验方法47-51
• 2 结果51-57
• 2.1 纯化蛋白的鉴定51
• 2.2 皮下免疫组血清中Ig G效价水平的检测51-52
• 2.3 滴鼻免疫气管与肺脏冲洗液中SIg A与Ig G抗体效价水平检测52-53
• 2.4 皮下免疫与滴鼻免疫Ig G抗体效价的比较53-54
• 2.5 各免疫组小鼠血清中细胞因子水平的检测54-56
• 2.6 攻毒保护结果56-57
• 3 讨论57-59
• 结论59-60
• 参考文献60-70
• 致谢70-71
• 作者简介71-72
• 导师简介72-73

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7 马，

本文编号：381589