磷脂酶D产生菌的分类鉴定及其基因的初步研究

发布时间：2023-05-03 22:08

　　磷脂具有良好的应用前景,但天然磷脂结构单一、含量低且种类较少。改性磷脂来源广泛、种类多、功能性强,成为近几年关注的焦点。酶改性则是一种高效温和的磷脂改性方法,其中磷脂酶D是一类特殊的酯键水解酶,在一定的条件下,它能水解磷脂生成磷脂酸和羟基化合物,并能催化某些含羟基的化合物结合到磷脂的酰基上,生成许多稀有磷脂和半合成磷脂,满足食品和医药等领域的需要。磷脂酶D广泛存在于微生物、植物、动物中,特别是来源于微生物的磷脂酶D,表现出很好的转酯能力和水解能力。实验室从土壤中筛选菌株,通过菌落水解圈法对菌种进行自然选育,并摇瓶复筛得到一株产磷脂酶D的菌株P1,目的菌株P1是革兰氏阳性、兼性厌氧、芽孢边端生的棒状杆菌。菌体长1.8-2.4μm,宽0.8-1.0μm;菌落呈黄白色,表面粗糙,中间隆起,边缘整齐。通过16S rRNA序列比对分析,该菌株与Bacillus cereus相似度为99.73%。最适生长条件:温度30℃,pH 6.0-7.0,不耐盐;其他各项生理生化鉴定结果与模式菌株基本一致;主要磷脂组分为磷脂酰乙醇胺PE和磷脂酰胆碱PC;G+C含量为42.01 mol%。菌株P1属于芽孢杆菌属...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 文献综述
    1.1 磷脂
        1.1.1 磷脂的来源组成及结构
        1.1.2 磷脂的性质
        1.1.3 磷脂功能
        1.1.4 磷脂改性
        1.1.5 磷脂的应用
    1.2 磷脂酶D
        1.2.1 磷脂酶
        1.2.2 磷脂酶D的概况
            1.2.2.1 磷脂酶D的来源
            1.2.2.2 磷脂酶D的生理功能
            1.2.2.3 磷脂酶D的催化反应机理
            1.2.2.4 磷脂酶D的反应影响因素
        1.2.3 磷脂酶D的应用
    1.3 本论文研究内容
第二章 磷脂酶D产生菌的筛选与鉴定
    2.1 材料与试剂
    2.2 仪器设备
    2.3 培养基
        2.3.1 生长培养基
        2.3.2 分类鉴定培养基
        2.3.3 标准菌株
    2.4 实验方法
        2.4.1 磷脂酶D产生菌的筛选
            2.4.1.1 磷脂酶D产生菌的初筛
            2.4.1.2 磷脂酶D产生菌的复筛
        2.4.2 培养特征分析
        2.4.3 形态特征分析
            2.4.3.1 革兰氏染色
            2.4.3.2 芽孢染色
            2.4.3.3 扫描电镜实验(SEM)
        2.4.4 16SrRNA的序列分析
        2.4.5 生理生化特征鉴定
            2.4.5.1 生长曲线
            2.4.5.2 生长温度范围
            2.4.5.3 生长pH范围
            2.4.5.4 耐盐度
            2.4.5.5 运动性实验
            2.4.5.6 需氧性试验
            2.4.5.7 石蕊牛奶实验
            2.4.5.8 酪素水解实验
            2.4.5.9 马尿酸盐水解实验
            2.4.5.10 卵磷脂酶实验
            2.4.5.11 过氧化氢酶(接触酶)实验
            2.4.5.12 明胶液化
            2.4.5.13 淀粉水解反应
            2.4.5.14 硝酸盐还原实验
            2.4.5.15 抗生素敏感实验
        2.4.6 化学特征分析-磷酸类脂分析
            2.4.6.1 菌体收集
            2.4.6.2 磷酸类脂的提取
            2.4.6.3 磷酸类脂显色剂配置
            2.4.6.4 点样与层析
            2.4.6.5 薄板显色
        2.4.7 分子特征分析-DNA(G+C)mol%含量分析
            2.4.7.1 DNA提取
            2.4.7.2 DNA的纯化
            2.4.7.3 DNA的纯度检测
            2.4.7.4 DNA的酶解
            2.4.7.5 G+C含量的测定
    2.5 结果与讨论
        2.5.1 磷脂酶D产生菌的筛选及培养特征分析
        2.5.2 形态特征分析
            2.5.2.1 革兰氏染色
            2.5.2.2 芽孢染色
            2.5.2.3 扫描电镜(SEM)
        2.5.3 系统发育树的构建
        2.5.4 生理生化特征鉴定
            2.5.4.1 生长曲线
            2.5.4.2 生长温度范围
            2.5.4.3 生长PH范围
            2.5.4.4 耐盐度
            2.5.4.5 生理生化特征实验结果
            2.5.4.6 抗生素敏感性
            2.5.4.7 化学特征分析-磷酸类脂分析结果
            2.5.4.8 基因特征——DNA(G+C)mol%含量分析
    2.6 本章小结
第三章 磷脂酶D活性检测方法的建立
    3.1 材料与试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 试剂配制
        3.2.2 粗酶液的制备
        3.2.3 最佳吸收波长的选择
        3.2.4 标准曲线的绘制
        3.2.5 酶活的测定
        3.2.6 发酵液用量的选择
        3.2.7 酶反应时间的选择
        3.2.8 雷氏盐用量的选择
        3.2.9 与雷氏盐反应时间的选择
        3.2.10 蛋白沉淀量对胆碱雷氏盐生成的影响
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 测定波长的选择
        3.3.2 标准曲线绘制和检出限
        3.3.3 发酵液用量的选择
        3.3.4 酶反应时间的选择
        3.3.5 雷氏盐用量的选择
        3.3.6 与雷氏盐反应时间的选择
        3.3.7 蛋白沉淀量对胆碱雷氏盐生成的影响
    3.4 本章小结
第四章 磷脂酶D基因表达载体的构建
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验试剂
        4.1.2 实验菌株及质粒
        4.1.3 PCR引物
        4.1.4 培养基
        4.1.5 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 目的基因扩增及验证
            4.2.1.1 目的基因扩增
            4.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳及胶回收
        4.2.2 克隆质粒的构建
            4.2.2.1 感受态细胞的制备
            4.2.2.2 质粒DNA转化方法
        4.2.3 PCR克隆检测及酶切验证
            4.2.3.1 PCR克隆检测
            4.2.3.2 质粒的提取(碱裂解法)
            4.2.3.3 酶切体系
        4.2.4 表达载体构建
            4.2.4.1 大肠杆菌表达宿主rosetta超级感受态的制备
            4.2.4.2 双酶切体系
            4.2.4.3 连接体系
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 磷脂酶D基因的筛选与克隆
        4.3.2 磷脂酶D基因的表达载体的构建
    4.4 本章小结
结论
参考文献
致谢



本文编号：3807373