小麦抗叶锈防卫反应相关基因TaNRH的克隆与功能分析

发布时间：2023-05-08 01:52

　　小麦叶锈菌属于专化性非常强的活体营养型真菌。在小麦与叶锈菌互作的不亲和组合中,寄主细胞通过过敏性反应(hypersensitive reaction,HR)的方式抵抗叶锈菌的侵染。NB-LRR类抗性蛋白是一种重要的R蛋白,根据N-端保守结构域的不同可以分为TIR-NB-LRR和CC-NB-LRR两类,近年来,关于CC-NB-LRR类蛋白在植物抗病方面的报道越来越多。实验室前期选用小麦近等基因系TcLr26与其轮回亲本Thatcher(Tc)分别与叶锈菌生理小种260组成不亲和(有HR)及亲和组合(无HR),进行转录组测序。本研究通过分析该转录组数据,筛选到一个CC-NB-LRR类基因家族的新成员,并且深入探讨了该基因在小麦抵抗叶锈菌侵染的HR诱发中的作用机制。所得主要结果如下:1.通过分析小麦与叶锈菌互作的转录组数据库筛选得到一个CC-NB-LRR类基因家族新成员,发现该基因在亲和组合中的表达几乎为0,而在不亲和组合中组成型表达,推测该基因可能与不亲和组合中寄主HR的发生相关,因此将其命名为TaNRH(NB-LRR gene required for HR)。生物信息学分析发现TaNR...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
英文缩写表
1 引言
    1.1 过敏性反应是小麦抵抗叶锈菌侵染的重要防卫反应
    1.2 NB-LRR类 R蛋白在植物免疫中的作用
        1.2.1 NB-LRR类蛋白的结构特点
        1.2.2 NB-LRR类蛋白的作用机制
    1.3 本试验研究内容及意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 供试材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 供试仪器设备
        2.1.4 培养基的配制
    2.2 试验中的引物序列
    2.3 试验方法
        2.3.1 PCR扩增TaNRH基因并获得CDS全长
        2.3.2 TaNRH基因编码蛋白特征和系统进化分析
        2.3.3 小麦与叶锈菌互作过程中TaNRH基因转录水平表达分析
        2.3.4 TaNRH的亚细胞定位检测
        2.3.5 利用VIGS技术探究TaNRH基因功能
        2.3.6 RNAi载体的构建及农杆菌介导的遗传转化
        2.3.7 超表达载体的构建及农杆菌介导的遗传转化
        2.3.8 利用酵母双杂交检测蛋白互作
        2.3.9 利用双分子荧光互补试验检测蛋白互作
3 结果与分析
    3.1 TaNRH基因的筛选
    3.2 CL61.contig-13 编码一个CC-NB-LRR类蛋白家族的新成员
    3.3 TaNRH在小麦与叶锈菌不亲和互作中为组成型表达
    3.4 TaNRH定位于细胞质中
        3.4.1 亚细胞定位载体的构建
        3.4.2 亚细胞定位观察
    3.5 利用VIGS技术沉默TaNRH后 HR的发生被明显减慢
        3.5.1 VIGS载体构建
        3.5.2 酶切线性化及体外转录
        3.5.3 BSMV转染病毒及沉默效率检测
        3.5.4 沉默目的基因后对HR及叶锈菌发育的影响
    3.6 利用RNAi技术沉默TaNRH后 HR的发生也被明显减慢
        3.6.1 RNAi载体构建
        3.6.2 农杆菌介导的幼穗遗传转化
        3.6.3 RNAi阳性植株的筛选
        3.6.4 RNAi阳性植株沉默效率检测
        3.6.5 沉默目的基因后对HR及叶锈菌发育的影响
    3.7 超表达TaNRH可诱发HR
        3.7.1 超表达载体构建
        3.7.2 超表达阳性植株的筛选
        3.7.3 超表达性植株中TaNRH表达量检测
        3.7.4 TaNRH基因超表达对HR及叶锈菌发育的影响
    3.8 TaNRH自身不发生相互作用
        3.8.1 利用酵母双杂交技术检测互作
        3.8.2 利用Bi FC技术检测互作
    3.9 TaNRH和 TaRanGAP2 之间能发生相互作用
        3.9.1 利用酵母双杂交技术检测互作
        3.9.2 利用Bi FC技术检测互作
4 讨论
    4.1 TaNRH基因在小麦抵御叶锈菌侵染过程中发挥重要作用
    4.2 TaNRH可能来自于黑麦
    4.3 TaNRH作用机制初探
5 结论
参考文献
在读期间发表的学术论文
作者简历
致谢



本文编号：3811743