病毒介导CRISPR/Cas9烟草基因编辑系统的研究

发布时间：2023-05-12 20:13

　　基因组编辑是利用序列特异核酸酶在基因组特定位点产生DNA双链断裂,激活细胞自身的修复机制(非同源末端连接或同源重组),实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换的技术。当有外源DNA或者病毒入侵,CRISPR/Cas系统会将入侵的序列片段整合进去,由特定的crRNA进行同源序列的降解。该系统构建简单、精准度高、成本低、能同时对多个位点进行定点编辑。本研究探索了利用豌豆早褐病毒介导CRISPR/Cas9系统的关键因子crRNA和Cas9蛋白在烟草中表达,期望实现对烟草基因进行编辑。主要结果如下:1、设计烟草PDS基因的目标编辑序列,设计引物扩增,酶切,与酶切后的pCAPE2-GFP连接获得pCAPE2:crRNA载体。利用农杆菌转化的方法获得遍在表达Cas9蛋白的转基因系。将pCAPE1和pCAPE2:crRNA质粒转化农杆菌GV3101,把包含pCAPE1和pCAPE2:Cas9-crRNA质粒的农杆菌1:1混合后侵染遍在表达Cas9蛋白的转基因系,但未能发现基因组编辑表型。2、获得烟草的crRNA序列。通过扩增得到Cas9片段,将载体和两个片段各自酶切,通过T4连接酶对该三片段进...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
符号或缩略词说明
前言
第一章 文献综述
    1.1 基因组编辑技术的发展介绍
        1.1.1 基因组编辑技术的应用现状
        1.1.2 人工核酸酶介导的基因组编辑
        1.1.3 基因组编辑技术在植物中的应用问题
    1.2 CRISPR/Cas简述
        1.2.1 CRISPR的研究历史
        1.2.2 CRISPR/Cas技术进行基因编辑的基本原理
    1.3 CRISPR/Cas系统的特点
        1.3.1 CRISPR/Cas的基因结构
        1.3.2 CRISPR/Cas的技术结构
    1.4 CRISPR/Cas9系统的应用
        1.4.1 CRISPR/Cas9系统在鱼类中的应用
        1.4.2 CRISPR/Cas9系统在老鼠中的应用
        1.4.3 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用
    1.5 病毒诱导的基因沉默
        1.5.1 病毒诱导基因沉默（VIGS）的发现
        1.5.2 RNA病毒诱导的基因沉默
        1.5.3 其他病毒诱导的基因沉默
        1.5.4 VIGS病毒载体的应用
        1.5.5 病毒诱导基因沉默（VIGS）的优缺点
    1.6 本项目的目的和意义
第二章 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂和菌株
    2.2 病毒介导crRNA在遍在表达Cas9蛋白的烟草转基因系中编辑
        2.2.1 PDS基因靶点序列设计
        2.2.2 crRNA的构建
        2.2.3 PEBV载体的处理
        2.2.4 单酶切pCAPE2-GFP质粒和酶切后的crRNA片段进行连接
        2.2.5 链接产物做DH5α（E.coli细胞 ）转化
        2.2.6 重组克隆的筛选
        2.2.7 质粒的提取与转化
            2.2.7.1 质粒的提取和纯度测量
            2.2.7.2 农杆菌的转化
            2.2.7.3 培养保存转化好的农杆菌
        2.2.8 获得遍在表达Cas9蛋白转基因系用pCAPE2：crRNA注射侵染
    2.3 病毒介导Cas9和crRNA在烟草中编辑
        2.3.1 Cas9和crRNA片段的获得
        2.3.2 Cas9和crRNA的片段的酶切
        2.3.3 对pCAPE2-GFP载体的双酶切
        2.3.4 pCAPE2：Cas9-crRNA载体片段的拼接
        2.3.5 pCAPE2：Cas9-crRNA病毒载体的注射
        2.3.6 表型分析
    2.4 病毒介导crRNA在配子特异表达Cas9蛋白的转基因系中编辑
        2.4.1 NtDMC1启动子的处理
        2.4.2 Cas9蛋白的整合
            2.4.2.1 BP反应
            2.4.2.2 LR反应
第三章 实验结果
    3.1 病毒介导crRNA在遍在表达Cas9基因的烟草转基因系中的编辑结果
        3.1.1 crRNA的构建
        3.1.2 pCAPE2-GFP的单酶切和双酶切结果
        3.1.3 pCAPE2:crRNA载体验证及其转化检测
        3.1.4 遍在表达Cas9基因的烟草转基因系的构建
        3.1.5 病毒载体pCAPE2：crRNA对遍在表达Cas9株系侵染
    3.2 病毒介导Cas9和crRNA在烟草中的编辑结果
        3.2.1 Cas9和crRNA片段的扩增结果
        3.2.2 连接转化DH5α，质粒提取
        3.2.3 质粒农杆菌转化结果
        3.2.4 无菌苗注射后的表型分析
        3.2.5 基因组编辑序列的检验
    3.3 病毒介导crRNA在配子特异表达Cas9转基因系中的编辑结果
        3.3.1 获得NtDMC1的片段
        3.3.2 将Cas9基因转移到入门载体
        3.3.3 pH7WG:NtDMC1：Cas9载体的构建验证
第四章 讨论
    4.1 CRISPR/Cas9系统介导的突变效率影响因素
    4.2 CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑的特异性
第五章 结论
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3814559