蓖麻RcPDAT1-2基因启动子的克隆及功能分析

发布时间：2023-06-05 20:28

　　植物转基因工程是作物遗传改良的重要手段与策略之一,启动子的灵活应用可以为外源基因的高效、特异性表达提供有效工具。人们利用不同类型的启动子驱动下游目的基因的表达,达到高效、稳定表达的目的。本研究以蓖麻油酸合成关键基因RCPZDAT1-2基因启动子为研究对象,探究RcPDAT1-2的表达调控机制,以通蓖5号蓖麻品种为材料,分析RcPDAT1-2基因,克隆RcPDAT1-2启动子全长和缺失序列,通过拟南芥转化验证功能,分析RcPDAT1-2启动子活性。实验结果如下:通过生物信息学分析RcPDAT1-2基因,结果表明:RcPDAT1-2基因共编码660个氨基酸,所编码的蛋白质无信号肽,为非分泌蛋白,存在跨膜结构域,含有2个LCAT结构域。RcPDAT1-2基因启动子顺式作用元件预测分析显示,启动子序列包含除了核心元件TATA-box和CAAT-box,还含有多个光响应元件、激素响应元件、逆境胁迫诱导响应元件以及MYB转录因子的结合位点等;RcPDA T1-2启动子全长的活性验证实验结果表明:成功克隆并构建RcPDAT1-2基因启动子全长表达载体pCAMBIA1303-PDAT1-2(1),转化...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
    1 蓖麻简介
    2 蓖麻油酸合成代谢途径及关键酶研究进展
        2.1 蓖麻油酸合成代谢途径研究进展
        2.2 蓖麻油酸合成代谢途径中的关键酶研究进展
            2.2.1 FAH12基因研究进展
            2.2.2 LPCAT基因研究进展
            2.2.3 PDCT基因研究进展
            2.2.4 PLA2基因研究进展
        2.3 RcPDAT1-2基因研究进展
    3 植物启动子的研究进展
        3.1 植物启动子概述
        3.2 植物启动子类型
            3.2.1 组成型启动子
            3.2.2 组织特异性启动子
            3.2.3 诱导型启动子
        3.3 植物启动子功能验证研究进展
        3.4 蓖麻启动子研究进展
    4 本研究的目的意义
第二章 蓖麻RcPDAT1-2基因启动子全长克隆及活性验证
    1 实验材料
        1.1 植物材料
        1.2 菌株与载体
        1.3 实验试剂
        1.4 培养基及试剂配制
        1.5 实验仪器
    2 实验方法
        2.1 蓖麻RcPDAT1-2基因及启动子生物信息学分析
        2.2 克隆RcPDAT1-2基因启动子全长序列
            2.2.1 提取蓖麻基因组DNA
            2.2.2 扩增RcPDAT1-2基因启动子全长序列
            2.2.3 扩增片段回收
            2.2.4 RcPDAT1-2启动子全长片段与克隆载体连接
            2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的转化
            2.2.6 克隆载体的验证
        2.3 构建RcPDAT1-2基因全长启动子表达载体
            2.3.1 pCAMBIA1303载体质粒提取
            2.3.2 pCAMBIA1303和pMD18T-PDAT1-2 (1)质粒的双酶切和胶回收
            2.3.3 RcPDAT1-2启动子全长序列与pCAMBIA1303表达载体连接
            2.3.4 转化大肠杆菌感受态细胞
            2.3.5 表达载体的验证
            2.3.6 转化农杆菌感受态细胞
            2.3.7 农杆菌菌液鉴定
        2.4 RcPDAT1-2基因全长启动子活性验证
    3 结果与分析
        3.1 蓖麻RcPDAT1-2基因及启动子生物信息学分析
            3.1.1 RcPLAT1-2基因生物信息学分析
            3.1.2 RcPDAT1-2启动子全长生物信息学分析
        3.2 克隆RcPDAT1-2基因启动子全长序列
            3.2.1 蓖麻基因组DNA提取
            3.2.2 扩增RcPDAT1-2启动子全长序列
            3.2.3 构建pMD18T-PDAT1-2(1)克隆载体并鉴定
        3.3 RcPDAT1-2基因启动子全长表达载体的构建
            3.3.1 pCAMBIA1303载体质粒提取结果
            3.3.2 pCAMBIA1303和pMD18T-PDAT1-2 (1)双酶切
            3.3.3 pCAMBIA1303-PDAT1-2 (1)表达载体构建及验证
            3.3.4 pCAMBIA1303-PDAT1-2 (1)重组质粒转化农杆菌
        3.4 RcPDAT1-2基因启动子全长活性验证
    4 小结
第三章 RcPDAT1-2启动子遗传转化及主要作用元件功能验证
    1 实验材料
        1.1 植物材料
        1.2 实验试剂及配制
    2 实验方法
        2.1 RcPDAT1-2缺失启动子的克隆
            2.1.1 克隆RcPDAT1-2缺失启动子的引物设计
            2.1.2 RcPDAT1-2缺失启动子序列扩增
            2.1.3 构建RcPDAT1-2缺失启动子的克隆载体
        2.2 构建RcPDAT1-2基因缺失启动子表达载体
        2.3 拟南芥遗传转化及转基因植株的鉴定
            2.3.1 拟南芥植株的种植及培养
            2.3.2 拟南芥的遗传转化
            2.3.3 转基因拟南芥的筛选
            2.3.4 转基因拟南芥的鉴定
            2.3.5 转基因拟南芥GUS染色分析
        2.4 RcPDAT1-2启动子主要顺式作用元件功能验证
            2.4.1 干旱响应元件功能验证
            2.4.2 低温响应元件功能验证
    3 结果与分析
        3.1 RcPDAT1-2缺失启动子的克隆
            3.1.1 扩增RcPDAT1-2缺失启动子序列
            3.1.2 RcPDAT1-2缺失启动子克隆载体的构建及鉴定
        3.2 构建RcPDA T1-2缺失启动子表达载体
            3.2.1 RcPDAT1-2缺失启动子表达载体的鉴定
            3.2.2 RcPDAT1-2缺失启动子表达载体转化农杆菌并鉴定
        3.3 拟南芥遗传转化及转基因植株的鉴定
        3.4 RcPDAT1-2启动子主要顺式作用元件功能验证
            3.4.1 干旱响应元件的功能验证
            3.4.2 低温响应元件的功能验证
    4 小结
第四章 讨论与结论
    1 讨论
        1.1 RcPDAT1-2基因生物信息学分析
        1.2 RcPDAT1-2启动子顺式作用元件
        1.3 启动子的功能验证
    2 结论
参考文献
致谢
作者简介
附录



本文编号：3831996