乏氧敏感基因载体的制备与评价
发布时间：2023-10-02 00:38
肿瘤细胞由于其异常的代谢,导致其与正常细胞组织出现差异化。这给众多研究者提供了设计肿瘤微环境响应的纳米材料或者前药的思路。其中由于肿瘤细胞代谢快,血管生成速度慢,肿瘤部位出现乏氧的特征,同时乏氧也是肿瘤出现耐药性和复发的重要原因。基因治疗是在分子层面上对细胞进行干预的治疗手段,被认为是一种极具效率的治疗方式。非病毒基因载体也因为其良好的生物安全性,较低的免疫原性以及易于修饰等特点而被广泛研究。但是由于非病毒类载体具有较高密度的阳离子,使得聚合物难以与负载的基因分离,所以其转染效率低下一直为人诟病。本论文的第一部分设计了一种乏氧响应的电荷反转的聚合物基因载体,由于肿瘤细胞内的乏氧条件,导致其硝基还原酶浓度上升,使得硝基类化合物能够被还原为氨基。该聚合物是含4-((4-硝基苄基)氧基)苄基的阳离子聚合物,能与核酸药物通过静电作用形成纳米复合物。进入细胞后,聚合物在硝基还原酶的作用下发生反应,电子重排后生成带负电的聚丙烯酸,迅速通过静电作用释放出核酸药物。论文第二部分将光热治疗与基因治疗相结合,以通过FAD批准的吲哚菁绿(ICG)作为光热试剂,通过siRNA沉默PKM2基因阻断ATP能量供应...
【文章页数】：101 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
1.1 癌症与癌症治疗
1.1.1 癌症
1.1.2 癌症的治疗
1.2 肿瘤的基因治疗
1.3 肿瘤基因治疗的药物载体
1.3.1 病毒类基因药物载体
1.3.2 非病毒类基因药物载体
1.3.2.1 阳离子脂质体作为基因载体
1.3.2.2 阳离子聚合物作为基因载体
1.4 阳离子聚合物的药物递送
1.4.1 基因药物递送过程中的生物屏障
1.4.2 基因递送各过程对电荷的要求
1.4.3 电荷反转纳米粒子用于药物的输送
1.5 刺激响应型纳米载体
1.5.1 pH响应的纳米载体
1.5.2 酶响应的纳米载体
1.5.3 氧化还原响应响应的纳米载体
1.5.4 乏氧响应的纳米载体
1.5.5 光响应的纳米载体
1.6 PKM2基因的研究现状
1.7 细胞膜包被的纳米载体
1.7.1 红细胞膜包被的纳米载体
1.7.2 巨噬细胞膜包被的纳米载体
1.7.3 癌细胞膜包被的纳米载体
1.8 课题的提出
第二章 乏氧响应电荷反转型阳离子聚合物的合成与表征
2.1 引言
2.2 实验仪器和材料
2.2.1 实验材料以及来源
2.2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 乏氧响应基因载体(4-((4-硝基苄基氧基)苯基)-N甲基季胺化聚乙烯亚胺的合成
2.3.1.1 单体前体1(4-((4-硝基苄基氧基)苯基)甲醇的合成
2.3.1.2 单体1丙烯酸4-((4-硝基苄基)氧基)苄基酯的合成
2.3.1.3 乏氧响应型基因运输载体HRP的合成
2.3.1.4 异硫氰酸酯罗丹明B(RBITC)标记的HRP的合成
2.3.2 对照组4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzylacrylate -quaternized PEI (PEI-BA)的合成
2.3.2.1 单体前体2(4-(苄氧基)苯基)甲醇的合成
2.3.2.2 单体2丙烯酸4-(苄氧基)苄基酯的合成
2.3.2.3 4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzyl acrylate-quaternized PEI (PEI-BA)的合成
2.3.3 高效液相色谱法检测单体前体1以及HRP在硝基还原酶下的响应
2.3.3.1 高效液相色谱法检测单体前体1在硝基还原酶下的释放
2.3.3.2 高效液相色谱法检测HRP在硝基还原酶下的响应
2.3.4 TOF-MS检测HRP在硝基还原酶下的响应
2.3.5 HRP在硝基还原酶的作用下发生电荷翻转
2.3.6 凝胶阻滞色谱阳离子聚合物HRP/siRNA纳米复合物的稳定性以及在硝基还原酶下的释放
2.3.6.1 阳离子聚合物HRP/siRNA复合物的制备
2.3.6.2 凝胶阻滞电泳检测阳离子聚合物HRP/siRNA复合物
2.3.6.3 凝胶阻滞电泳验证阳离子聚合物HRP/siRNA在硝基还原酶的条件下siRNA的释放
2.3.7 使用MTT测试阳离子聚合物、其对照物、PEI25K细胞毒性
2.3.7.1 细胞培养
2.3.7.2 使用MTT测试阳离子聚合物、PEI-BA以及PEI25K细胞毒性
2.4 实验结果讨论
2.4.1 乏氧响应型基因运输载体HRP的合成表征结果
2.4.1.1 单体前体1(4-((4-硝基苄基氧基)苯基)甲醇结果表征
2.4.1.2 单体1丙烯酸4-((4-硝基苄基)氧基)苄基酯的合成的表征结果
2.4.1.3 乏氧响应型基因运输载体HRP的合成表征结果
2.4.2 对照组4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzyacrylate -quaternized PEI (PEI-BA)的合成
2.4.2.1 单体前体2 (4-(苄氧基)苯基)甲醇的合成的表征结果
2.4.2.2 单体2丙烯酸4-(苄氧基)苄基酯的合成的表征结果
2.4.2.3 对照组4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzylacrylate -quaternized PEI(PEI-BA)的表征结果
2.4.3 高效液相色谱法检测单体前体1与HRP硝基还原酶下的响应结果
2.4.3.1 高效液相色谱法检测单体前体1在硝基还原酶下的释放
2.4.3.2 高效液相色谱法检测HRP硝基还原酶下的释放
2.4.4 TOF-MS检测HRP在硝基还原酶下的响应
2.4.5 HRP在硝基还原酶的作用下发生电荷翻转
2.4.6 凝胶阻滞电泳实验检测HRP纳米复合物的稳定性以及在硝基还原酶响应下siRNA的释放
2.4.6.1 凝胶阻滞电泳实验检测HRP与siRNA的质量比
2.4.6.2 凝胶阻滞电泳实验检测HRP在硝基还原酶响应下siRNA的释放
2.4.7 使用MTT测试阳离子聚合物HRP的细胞毒性并且与其对照物、PEI25K进行比较
2.5 小结
第三章 膜融合乏氧响应纳米粒子的构建与表征
3.1 引言
3.2 实验材料与实验仪器
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验细胞培养以及基因序列
3.3 实验方法
3.3.1 阳离子聚合物HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.2 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.2.1 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.2.2 脂质体载药量以及包封率
3.3.2.3 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的粒径表征
3.3.2.4 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的凝胶电泳实验
3.3.3 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.3.1 巨噬细胞膜的提取
3.3.3.2 巨噬细胞膜包被的纳米粒子的制备
3.3.4 膜融合脂质体包裹的RHRP/siRNA/ICG纳米复合物电镜图
3.3.5 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物光热曲线
3.3.6 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物ROS的生成
3.3.7 膜融合脂质体包裹的RHRP/siRNA/ICG纳米复合物细胞摄取
3.3.8 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物基因沉默效率
3.3.8.1 4T1细胞luciferase基因沉默
3.3.8.2 实时PCR进行体外基因沉默测定
3.3.9 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物MTT实验
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 阳离子聚合物HRP/siRNA/ICG纳米复合物凝胶阻滞图
3.4.2 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备与表征
3.4.2.1 脂质体载药率以及包封率
3.4.2.2 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的表征
3.4.3 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物SDS-PAGE表征
3.4.4 膜融合脂质体包裹的RHRP/siRNA/ICG纳米复合物电镜图
3.4.5 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物光热曲线
3.4.6 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物ROS的生成
3.4.7 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物细胞摄取
3.4.8 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物基因沉默效率
3.4.8.1 4T1细胞luciferase基因沉默结果
3.4.8.2 实时PCR进行体外基因沉默测定
3.4.9 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物MTT实验
3.5 小结
第四章 总结与展望
参考文献
致谢
导师与作者简介
附件
本文编号：3849751
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【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
1.1 癌症与癌症治疗
1.1.1 癌症
1.1.2 癌症的治疗
1.2 肿瘤的基因治疗
1.3 肿瘤基因治疗的药物载体
1.3.1 病毒类基因药物载体
1.3.2 非病毒类基因药物载体
1.3.2.1 阳离子脂质体作为基因载体
1.3.2.2 阳离子聚合物作为基因载体
1.4 阳离子聚合物的药物递送
1.4.1 基因药物递送过程中的生物屏障
1.4.2 基因递送各过程对电荷的要求
1.4.3 电荷反转纳米粒子用于药物的输送
1.5 刺激响应型纳米载体
1.5.1 pH响应的纳米载体
1.5.2 酶响应的纳米载体
1.5.3 氧化还原响应响应的纳米载体
1.5.4 乏氧响应的纳米载体
1.5.5 光响应的纳米载体
1.6 PKM2基因的研究现状
1.7 细胞膜包被的纳米载体
1.7.1 红细胞膜包被的纳米载体
1.7.2 巨噬细胞膜包被的纳米载体
1.7.3 癌细胞膜包被的纳米载体
1.8 课题的提出
第二章 乏氧响应电荷反转型阳离子聚合物的合成与表征
2.1 引言
2.2 实验仪器和材料
2.2.1 实验材料以及来源
2.2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 乏氧响应基因载体(4-((4-硝基苄基氧基)苯基)-N甲基季胺化聚乙烯亚胺的合成
2.3.1.1 单体前体1(4-((4-硝基苄基氧基)苯基)甲醇的合成
2.3.1.2 单体1丙烯酸4-((4-硝基苄基)氧基)苄基酯的合成
2.3.1.3 乏氧响应型基因运输载体HRP的合成
2.3.1.4 异硫氰酸酯罗丹明B(RBITC)标记的HRP的合成
2.3.2 对照组4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzylacrylate -quaternized PEI (PEI-BA)的合成
2.3.2.1 单体前体2(4-(苄氧基)苯基)甲醇的合成
2.3.2.2 单体2丙烯酸4-(苄氧基)苄基酯的合成
2.3.2.3 4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzyl acrylate-quaternized PEI (PEI-BA)的合成
2.3.3 高效液相色谱法检测单体前体1以及HRP在硝基还原酶下的响应
2.3.3.1 高效液相色谱法检测单体前体1在硝基还原酶下的释放
2.3.3.2 高效液相色谱法检测HRP在硝基还原酶下的响应
2.3.4 TOF-MS检测HRP在硝基还原酶下的响应
2.3.5 HRP在硝基还原酶的作用下发生电荷翻转
2.3.6 凝胶阻滞色谱阳离子聚合物HRP/siRNA纳米复合物的稳定性以及在硝基还原酶下的释放
2.3.6.1 阳离子聚合物HRP/siRNA复合物的制备
2.3.6.2 凝胶阻滞电泳检测阳离子聚合物HRP/siRNA复合物
2.3.6.3 凝胶阻滞电泳验证阳离子聚合物HRP/siRNA在硝基还原酶的条件下siRNA的释放
2.3.7 使用MTT测试阳离子聚合物、其对照物、PEI25K细胞毒性
2.3.7.1 细胞培养
2.3.7.2 使用MTT测试阳离子聚合物、PEI-BA以及PEI25K细胞毒性
2.4 实验结果讨论
2.4.1 乏氧响应型基因运输载体HRP的合成表征结果
2.4.1.1 单体前体1(4-((4-硝基苄基氧基)苯基)甲醇结果表征
2.4.1.2 单体1丙烯酸4-((4-硝基苄基)氧基)苄基酯的合成的表征结果
2.4.1.3 乏氧响应型基因运输载体HRP的合成表征结果
2.4.2 对照组4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzyacrylate -quaternized PEI (PEI-BA)的合成
2.4.2.1 单体前体2 (4-(苄氧基)苯基)甲醇的合成的表征结果
2.4.2.2 单体2丙烯酸4-(苄氧基)苄基酯的合成的表征结果
2.4.2.3 对照组4-(苄氧基)丙烯酸苄酯-N甲基季胺化聚乙烯亚胺(4-(benzyloxy)benzylacrylate -quaternized PEI(PEI-BA)的表征结果
2.4.3 高效液相色谱法检测单体前体1与HRP硝基还原酶下的响应结果
2.4.3.1 高效液相色谱法检测单体前体1在硝基还原酶下的释放
2.4.3.2 高效液相色谱法检测HRP硝基还原酶下的释放
2.4.4 TOF-MS检测HRP在硝基还原酶下的响应
2.4.5 HRP在硝基还原酶的作用下发生电荷翻转
2.4.6 凝胶阻滞电泳实验检测HRP纳米复合物的稳定性以及在硝基还原酶响应下siRNA的释放
2.4.6.1 凝胶阻滞电泳实验检测HRP与siRNA的质量比
2.4.6.2 凝胶阻滞电泳实验检测HRP在硝基还原酶响应下siRNA的释放
2.4.7 使用MTT测试阳离子聚合物HRP的细胞毒性并且与其对照物、PEI25K进行比较
2.5 小结
第三章 膜融合乏氧响应纳米粒子的构建与表征
3.1 引言
3.2 实验材料与实验仪器
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验细胞培养以及基因序列
3.3 实验方法
3.3.1 阳离子聚合物HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.2 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.2.1 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.2.2 脂质体载药量以及包封率
3.3.2.3 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的粒径表征
3.3.2.4 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的凝胶电泳实验
3.3.3 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备
3.3.3.1 巨噬细胞膜的提取
3.3.3.2 巨噬细胞膜包被的纳米粒子的制备
3.3.4 膜融合脂质体包裹的RHRP/siRNA/ICG纳米复合物电镜图
3.3.5 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物光热曲线
3.3.6 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物ROS的生成
3.3.7 膜融合脂质体包裹的RHRP/siRNA/ICG纳米复合物细胞摄取
3.3.8 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物基因沉默效率
3.3.8.1 4T1细胞luciferase基因沉默
3.3.8.2 实时PCR进行体外基因沉默测定
3.3.9 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物MTT实验
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 阳离子聚合物HRP/siRNA/ICG纳米复合物凝胶阻滞图
3.4.2 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的制备与表征
3.4.2.1 脂质体载药率以及包封率
3.4.2.2 脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物的表征
3.4.3 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物SDS-PAGE表征
3.4.4 膜融合脂质体包裹的RHRP/siRNA/ICG纳米复合物电镜图
3.4.5 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物光热曲线
3.4.6 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物ROS的生成
3.4.7 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物细胞摄取
3.4.8 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物基因沉默效率
3.4.8.1 4T1细胞luciferase基因沉默结果
3.4.8.2 实时PCR进行体外基因沉默测定
3.4.9 膜融合脂质体包裹的HRP/siRNA/ICG纳米复合物MTT实验
3.5 小结
第四章 总结与展望
参考文献
致谢
导师与作者简介
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