玉米大斑病菌StRALF基因的克隆与表达分析

发布时间：2023-10-21 10:40

　　玉米大斑病是世界玉米主产区的主要叶部病害。发病严重时常常造成巨大经济损失。在中国东北、西北、华北北部和南方山区的冷凉玉米种植区该病害发生较重。本文以快速碱化因子(RALF,Rapid alkalization factor)为研究对象,对玉米大斑病菌中StRALF基因保守序列进行了克隆,使用编码序列末端快速克隆技术(RACE)获得了cDNA序列全长,并对其编码蛋白进行了相关生物信息学分析,使用荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术对其进行了不同酸碱条件和不同侵染时期基因表达分析,结果如下:成功克隆玉米大斑病菌中StRALF基因保守序列,其长度为114 bp。通过对该基因保守序列编码蛋白进行生物信息学分析,可知此段序列编码37个氨基酸,推测分子量约为3.6 KD,理论等电点为7.74。经过氨基酸同源性比对分析,其与已公布的RALF蛋白具有一定同源性,但不完全保守。利用RACE技术获得StRALF基因的cDNA序列全长为279 bp,生物信息学分析后确定其编码92个氨基酸,推测为分泌蛋白。此蛋白不含有螺旋区域,所以不会执行代谢调节、识别分子、膜通道等功能。经过氨基酸同源性分析比对,所...

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
第一章 玉米大斑病菌致病基因研究进展
    1.1 玉米大斑病菌研究进展
        1.1.1 玉米大斑病的发生与危害
        1.1.2 玉米大斑病菌的生物学研究
        1.1.3 玉米大斑病菌中致病基因的研究
    1.2 快速碱化因子(RALF)相关研究
        1.2.1 植物和真菌中的多肽激素
        1.2.2 快速碱化因子的发现(RALF家族)
        1.2.3 真菌中的RALF
    1.3 基因研究技术的发展
        1.3.1 基因克隆
        1.3.2 RT-qPCR技术
    1.4 获得c DNA全长的相关研究
        1.4.1 获得c DNA全长的方法
        1.4.2 RACE的技术原理
        1.4.3 RACE技术的发展
        1.4.4 基因研究中RACE技术的使用
    1.5 生物信息学分析
第二章 玉米大斑病菌中StRALF基因的克隆
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 试验菌株
        2.1.2 试验主要试剂
        2.1.3 试验主要培养基
        2.1.4 试验主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 菌株的获得与培养
        2.2.2 StRALF基因保守区克隆引物的获得
        2.2.3 总RNA的提取
        2.2.4 StRALF基因保守区的PCR扩增
        2.2.5 目的片段的纯化回收
        2.2.6 回收产物的连接、转化
        2.2.7 菌液PCR以及质粒提取
        2.2.8 测序
    2.3 结果与分析
        2.3.1 获得StRALF基因保守区序列
        2.3.2 StRALF基因保守区PCR结果
        2.3.3 确定克隆得到的保守区氨基酸序列
        2.3.4 克隆保守区的理化性质
    2.4 本章小结
第三章 StRALF基因c DNA序列分析
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 试验菌株
        3.1.2 试验试剂
        3.1.3 试验所需培养基
        3.1.4 试验仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 总RNA的提取
        3.2.2 cDNA第一条链的合成
        3.2.3 3 ’RACE试验
        3.2.4 5 ’RACE试验
        3.2.5 目的片段回收
        3.2.6 测序
        3.2.7 完整开放阅读框的测序
        3.2.8 StRALF基因完整编码区生物信息学分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 3 ’RACE PCR扩增结果
        3.3.2 5 ’RACE PCR扩增结果
        3.3.3 克隆及测序结果
        3.3.4 StRALF的理化性质
        3.3.5 StRALF蛋白的亲疏水性
        3.3.6 StRALF蛋白跨膜情况
        3.3.7 StRALF蛋白信号肽预测
        3.3.8 StRALF蛋白Coil区域分析
        3.3.9 StRALF蛋白同源性分析
    3.4 本章小结
第四章 StRALF基因RT-qPCR表达量分析与相关生物学特性
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 试验菌株
        4.1.2 试验试剂
        4.1.3 试验所需培养基
        4.1.4 试验所需仪器与耗材
    4.2 St RALF 基因实时荧光定量 PCR 试验方法
        4.2.1 不同pH值条件下的菌株培养与收集
        4.2.2 不同侵染时期的菌体培养与收集
        4.2.3 不同酸碱条件下病菌侵染寄主的菌体培养与收集
        4.2.4 总RNA的提取与反转录
        4.2.5 实时荧光定量PCR引物选择
        4.2.6 所需引物特异性检测
        4.2.7 StRALF基因保守区RT-qPCR反应体系与程序
    4.3 玉米大斑病菌碱化因子生物学特性试验
    4.4 结果与分析
        4.4.1 引物特异性检测结果
        4.4.2 不同pH培养条件下StRALF表达量分析
        4.4.3 真菌对寄主侵染过程中StRALF表达量分析
        4.4.4 不同pH下真菌侵染寄主后StRALF表达量分析
        4.4.5 pH对试验菌株的生长及产孢量的影响
        4.4.6 不同pH值培养基中菌体表型观察
        4.4.7 不同pH培养条件下侵染点的观察
    4.5 本章小结
第五章 结论与讨论
    5.1 结论
        5.1.1 StRALF基因保守区克隆结果分析
        5.1.2 StRALF基因c DNA全长获取及相关研究
        5.1.3 StRALF基因实时荧光定量结果与相关生物学特性
    5.2 展望与讨论
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表论文



本文编号：3855672