结球甘蓝离体遗传转化体系的建立及转FOC1基因植株的获得

发布时间：2017-05-24 02:15

  本文关键词：结球甘蓝离体遗传转化体系的建立及转FOC1基因植株的获得，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甘蓝枯萎病是多年来导致全世界甘蓝质量下降、产量严重受损的一种毁灭性的土传病害[1]。实验室前期与中国农业科学院蔬菜花卉研究所合作,从甘蓝中鉴定了一个甘蓝枯萎病抗性候选基因FOC1,但一直没有能够对这个基因的相关抗性功能进行相应的验证。本文从甘蓝植株的苗龄、不同激素添加浓度组合、Ag NO3浓度等方面研究了它们对再生体系的影响情况,综合数据后建立了甘蓝的高效再生体系。再从筛选剂浓度、农杆菌抑制剂最适浓度和农杆菌菌液浓度和侵染时间长短对甘蓝遗传转化体系的影响,建立了甘蓝遗传转化的体系。为研究甘蓝抗枯萎病基因FOC1在转基因甘蓝中的抗性功能,利用本实验室前期克隆的FOC1基因,以p BI121质粒为植物表达载体,利用Infusion方法构建FOC1基因的正义表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并以表现为高感枯萎病的甘蓝自交系213为植物受体材料,该抗性基因通过农杆菌介导的遗传转化方法成功的被转化,获得了整合FOC1抗性基因的转基因甘蓝植株,并利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。本论文的主要研究结果如下:1.甘蓝外植体高效再生体系和遗传转化体系的建立选择4d苗龄的甘蓝幼苗作为试验所用受体材料;当激素组合浓度为6-BA 3 mg/L+NAA 0.1mg/L时,外植体再生率高达31.4%;本研究的结果显示对于此品种的甘蓝外植体,Ag NO3并没有促进分化的作用。对于甘蓝的转化,因此选用筛选剂浓度为10 mg/L的Kan对抗性芽进行初步的筛选;农杆菌抑菌剂选择了对农杆菌抑制效果好同时对芽生长无影响的特美汀,最适浓度为150 mg/L;农杆菌菌液浓度以OD600为0.5,侵染时间为5min最适合。2.FOC1基因正义表达载体的构建根据实验室前期利用RACE技术获得的FOC1全长序列信息,在目的基因特异的上下游引物的5’端添加与连接载体末端同源的15 bp碱基,以反转录获得的c DNA为模板,利用上述设计的特异引物In-fusion ZY-FOCF/R,扩增FOC1基因的CDS全长。内切酶XbaⅠ和SacⅠ将植物表达载体p BI121双酶切后,利用Infusion方法与目的片段连接后得到重组载体,最后通过热激法将重组载体p BI121-35S-FOC1成功转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10中。3.植物表达载体的遗传转化与转基因苗的鉴定重组载体进行农杆菌转化之后,利用农杆菌作为媒介,将植物表达载体导入到受体甘蓝的植株。农杆菌转入甘蓝受体植株当中后,经过一系列的共培养及筛选过程,最后共获得了40株抗卡那霉素的抗性甘蓝植株,初步大量提取植物的DNA,PCR检测有10株为阳性植株。表明重组载体已成功导入到受体甘蓝植株中。但其究竟与甘蓝植株的基因组是否整合,基因是否能正常表达,是否能翻译出具有功能的蛋白,还需要进一步通过Southern,Northern和Western等手段进一步验证。
【关键词】：甘蓝 抗枯萎病基因 pBI121质粒 载体构建 再生体系 遗传转化
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S635.1
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-6
• 缩略词表6-9
• 第一章 文献综述9-20
• 1.1 植物基因工程概况9-16
• 1.1.1 植物转基因方法和原理9-14
• 1.1.1.1 载体介导法：主要为根癌农杆菌介导的遗传转化10-11
• 1.1.1.2 DNA直接导入法11-14
• 1.1.1.3 其它14
• 1.1.2 植物转基因研究进展14-16
• 1.2 甘蓝再生体系研究进展16-18
• 1.3 甘蓝类蔬菜转基因概况18
• 1.3.1 抗虫基因：主要为Bt基因18
• 1.3.2 抗病基因18
• 1.3.3 育性基因18
• 1.3.4 抗除草剂基因18
• 1.4 研究目的和意义18-20
• 第二章 结球甘蓝外植体高效再生体系的建立20-25
• 2.1 试验材料20-21
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 试验所用器材20
• 2.1.3 培养基及主要添加成分配制20-21
• 2.2 试验方法21-22
• 2.2.1 甘蓝无菌苗的获得21-22
• 2.2.2 不同苗龄对不定芽分化的影响22
• 2.2.3 AgNO_3对不定芽分化的影响22
• 2.2.4 激素配比对不定芽分化的影响22
• 2.3 结果与分析22-25
• 2.3.1 苗龄对不定芽分化的影响22-23
• 2.3.2 AgNO_3对甘蓝再生体系的影响23
• 2.3.3 不同浓度组合的 6-BA和NAA对甘蓝再生体系的影响23-25
• 第三章 结球甘蓝遗传转化体系的建立25-30
• 3.1 试验材料25
• 3.1.1 甘蓝受体材料25
• 3.1.2 菌株和质粒材料25
• 3.1.3 培养基及主要添加成分25
• 3.2 试验方法25-26
• 3.2.1 农杆菌菌液的制备25-26
• 3.2.2 农杆菌介导遗传转化26
• 3.2.3 筛选压的确定26
• 3.2.4 农杆菌抑制剂最适浓度的确定26
• 3.2.5 农杆菌菌液浓度及侵染时间对遗传转化的影响26
• 3.3 结果与分析26-30
• 3.3.1 筛选剂最适浓度的确定26-27
• 3.3.2 农杆菌抑制剂最适浓度的确定27-28
• 3.3.3 菌液浓度及侵染时间对遗传转化的影响28-30
• 第四章 FOC1植物表达载体的构建和遗传转化30-40
• 4.1 试验材料30-31
• 4.1.1 植物材料30
• 4.1.2 菌株和试剂30
• 4.1.3 试验仪器30
• 4.1.4 培养基和主要添加成分30
• 4.1.5 所用PCR引物30-31
• 4.1.6 培养基31
• 4.2 试验方法31-35
• 4.2.1 甘蓝抗枯萎病基因FOC1正义表达载体的构建31-32
• 4.2.1.1 目的片段扩增与载体酶切31-32
• 4.2.1.2 抗枯萎病基因FOC1植物表达载体的构建32
• 4.2.2 植物表达载体pBI121-35S-FOC1的转化32-34
• 4.2.2.1 根癌农杆菌感受态的制备32-33
• 4.2.2.2 重组质粒pBI121-35S-FOC1转化农杆菌33
• 4.2.2.3 农杆菌侵染甘蓝植株33-34
• 4.2.3 转基因甘蓝植株的鉴定34-35
• 4.2.3.1 CTAB法大量提取甘蓝叶片DNA34
• 4.2.3.2 转基因甘蓝植株的PCR鉴定34-35
• 4.3 结果与分析35-40
• 4.3.1 甘蓝抗枯萎病基因FOC1正义表达载体的构建35-36
• 4.3.2 植物表达载体pBI121-35S-FOC1的鉴定36-37
• 4.3.3 植物表达载体pBI121-35S-FOC1转化农杆菌的检测37-38
• 4.3.4 甘蓝转基因植株的获得38
• 4.3.5 转基因甘蓝植株的PCR检测38-40
• 第五章 讨论与结论40-43
• 5.1 讨论40-42
• 5.1.1 苗龄、AgNO_3和最适激素配比对甘蓝再生体系中的影响40-41
• 5.1.2 农杆菌菌液浓度与侵染时间的确定41
• 5.1.3 甘蓝遗传转化体系中筛选剂和农杆菌抑制剂浓度的确定41-42
• 5.2 结论42-43
• 参考文献43-49
• 致谢49-50
• 作者简介50-51
• 导师简介51-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孙广华;原换换;樊晓聪;顾海科;宋梅芳;肖阳;孟凡华;郭林;杨青华;詹克慧;杨建平;;甘蓝光敏色素B基因的克隆及在拟南芥中异源转基因的功能验证[J];中国农业科学;2015年22期

2 刘娜;倪志勇;张海燕;邱迎风;陈全家;曲延英;;棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究[J];中国农学通报;2015年31期

3 陈菲帆;王琪琦;钟辉丽;付冰冰;任丹莉;李玉红;;基于In-fusion技术的ERECTA基因植物表达载体的构建[J];北方园艺;2015年18期

4 郭坤鹏;于月华;刘娜;康嘉楠;崔雪;王丽芳;倪志勇;;大豆GmF-box基因植物表达载体的构建及转化拟南芥[J];湖北农业科学;2015年08期

5 王丽;仪登霞;杨丽梅;刘建萍;方智远;程斐;刘玉梅;庄木;张扬勇;孙培田;;转Bt基因早熟春甘蓝抗虫材料的获得[J];中国蔬菜;2014年10期

6 王芳;姜静;;不同抗生素对紫雨桦离体叶片愈伤组织诱导的影响[J];西南林业大学学报;2014年03期

7 王鹏;刘永兰;雷小英;郭瑞娟;向安;郭晏海;;In-Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒[J];现代仪器与医疗;2014年02期

8 尤佳;张宁;文义凯;吴家和;司怀军;王蒂;;CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化[J];草业学报;2014年01期

9 李慧仙;朱平;;同源区段长度对In-Fusion技术连接效率的影响[J];中国医药生物技术;2013年04期

10 李彩红;李志芳;冯自力;赵丽红;师勇强;王玲飞;刘义杰;朱荷琴;;农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用[J];棉花学报;2013年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 仪登霞;转Bt双价基因甘蓝的抗虫性及遗传稳定性研究[D];中国农业大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前9条

1 刘品;根癌农杆菌介导WIN1基因在甘蓝型油菜中的转化[D];郑州大学;2012年

2 王银娟;根癌农杆菌介导的菜心（Brassica campestris L.Subsp.chinensis Makino var.parachinensis Tsenet Lee）遗传转化与优化研究[D];河南农业大学;2012年

3 吴娜拉胡;转Bt cry1Ba3和Bt cry1Ia8基因抗虫花椰菜的研究[D];东北农业大学;2012年

4 仪登霞;甘蓝转crylIa8和crylBa3双价Bt基因的研究[D];中国农业科学院;2011年

5 张永侠;农杆菌介导的转Bt cry1Iα基因抗虫花椰菜的研究[D];东北农业大学;2010年

6 邹智;油菜安全高效转化体系研究[D];中国农业科学院;2008年

7 于守江;Cry Ⅰ AC基因的克隆及转化结球甘蓝的研究[D];东北农业大学;2007年

8 叶霁;杜氏盐藻GFP表达载体的构建及电转化[D];安徽农业大学;2006年

9 张军杰;白菜抗虫转基因研究[D];四川农业大学;2002年

  本文关键词：结球甘蓝离体遗传转化体系的建立及转FOC1基因植株的获得，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：389627