马铃薯miRNA164及其靶基因功能研究

发布时间：2017-05-25 03:05

  本文关键词：马铃薯miRNA164及其靶基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是内源性的调节基因转录后水平的一类小分子RNA。NAC转录因子是一类在植物抗逆信号网络中发挥多种生物学功能的转录因子,干旱、盐碱等逆境胁迫能够诱导植物表达该基因。研究表明miRNA164的靶基因NAC在模式植物拟南芥中参与调控植物的生长发育以及对生物和非生物胁迫的耐受性。目前在马铃薯中关于miRNA164参与调控NAC表达模式的研究尚未见报道。本研究利用mi RNA164/NAC表达模式的保守性,用马铃薯中已知的miRNA164序列,通过在线工具对其靶基因进行预测并克隆获得了其靶基因NAC262,构建了其植物表达载体,转化马铃薯栽培品种“克新3号”获得了转基因植株。另外,利用人工miRNA(artificial mi RNA,amiRNA)技术构建了马铃薯mi RNA164表达载体,并转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”获得了转基因马铃薯植株。通过转基因植株NAC262基因表达量的qRT-PCR分析和形态学的观察对miRNA164/NAC的表达模式进行了研究。取得的主要结果如下:1.通过在线工具psRNATarget对miRNA164靶基因进行预测得到3个靶基因。通过生物信息学分析发现,这3个靶基因均属于NAC转录因子家族的NAM亚家族,且基因结构具有很高的保守性。2.以NCBI登记的马铃薯NAC262基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得了马铃薯转录因子基因NAC262的cDNA序列,并构建了CaMV 35S启动子驱动的NAC262基因的植物表达载体pCPB-NAC262;以马铃薯栽培品种“克新3号”无菌试管苗为实验材料,用农杆菌介导法进行遗传转化,经卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定获得了8株转基因植株。3.利用人工miRNA技术构建了CaMV 35S驱动的马铃薯mi RNA164的人工表达载体pCPB121-miR164,以马铃薯栽培品种“甘农薯2号”无菌试管苗为实验材料,经农杆菌介导法的遗传转化获得了10株转基因植株。4.用PEG6000对转基因植株进行胁迫处理,利用qRT-PCR对NAC262基因表达量分析结果显示:在20%的PEG胁迫下,0-8 h内NAC262基因表达量呈现上升的趋势,在胁迫达到8 h时NAC262基因表达量达到了最大值,在8-32 h时,NAC262基因表达量呈现下调的趋势;NAC262基因在胁迫的各个时间段根部的表达量高于茎叶组织。转mi RNA164基因株系T1和T2在PEG胁迫下,NAC262基因相对表达量明显低于非转基因“甘农薯2号”植株;而转NAC262基因株系T3和T4在PEG胁迫下,NAC262基因相对表达量明显高于非转基因“克新3号”植株。5.对每个株系随机的5株进行侧根数目和侧根长度统计发现:与非转基因对照相比,转miRNA164基因的“甘农薯2号”株系T1和T2侧根的数目明显的减少,但侧根的长度无显著的变化;而转NAC262基因的“克新3号”株系T3和T4与非转基因植株相比,侧根的数目明显的增多,根的长度变短,且叶片变大,茎秆加粗。综上所述,NAC262转录因子能够调控植物侧根的发育,且表达受到miRNA164的调控,miRNA164/NAC的表达模式存在高度的保守性,与拟南芥的类似,同时受PEG胁迫的诱导而参与了植物对干旱胁迫的响应。
【关键词】：马铃薯 miRNA164 NAC转录因子 人工miRNA
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 摘要7-9
• Summary9-11
• 第一章 文献综述11-21
• 1.1 microRNA概述11-15
• 1.1.1 microRNA的发现11-12
• 1.1.2 miRNA的研究进展12-13
• 1.1.3 植物miRNA的特点13
• 1.1.4 植物miRNA的作用机制13-14
• 1.1.5 植物miRNA的功能14-15
• 1.1.5.1 miRNA与植物的生长发育14-15
• 1.1.5.2 miRNA与植物抗逆境胁迫15
• 1.2 转录因子15-18
• 1.2.1 转录因子的基本特征15-16
• 1.2.2 NAC转录因子的基本特点16-18
• 1.2.3 NAC转录因子的研究进展18
• 1.3 本研究的目的和意义18-20
• 1.4 技术路线20-21
• 第二章 材料与方法21-42
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 菌株和载体21
• 2.1.3 数据库与分析软件21-22
• 2.1.4 试剂及仪器22
• 2.1.5 培养基的配制22-23
• 2.2 实验方法23-42
• 2.2.1 miRNA164靶基因的预测23-24
• 2.2.2 靶基因生物信息学分析24
• 2.2.3 引物的设计与合成24
• 2.2.4 马铃薯NAC262基因的克隆24-28
• 2.2.4.1 马铃薯试管薯总RNA的提取24-25
• 2.2.4.2 cDNA第一链的合成25-26
• 2.2.4.3 马铃薯NAC262基因的PCR扩增26
• 2.2.4.4 PCR产物纯化回收26-27
• 2.2.4.5 目的片段与克隆载体的连接27
• 2.2.4.6 大肠杆菌感受态细胞的制备27
• 2.2.4.7 连接产物的转化27-28
• 2.2.5 miR164克隆载体的构建28-31
• 2.2.5.1 miR164前体片段的PCR扩增28-30
• 2.2.5.2 d片段与克隆载体pMD®18-T的连接30-31
• 2.2.6 马铃薯NAC262基因和miR164植物表达载体的构建31-36
• 2.2.6.1 马铃薯NAC262基因表达载体的构建原理31-32
• 2.2.6.2 表达载体pCPB121的构建32-33
• 2.2.6.3 马铃薯表达载体pCPB121-miR164的构建33-34
• 2.2.6.4 质粒DNA的提取34
• 2.2.6.5 表达载体pCPB和克隆载体pMD-NAC262双酶切34
• 2.2.6.6 表达载体pCPB121和克隆载体pMD-miR164双酶切34
• 2.2.6.7 酶切产物的回收34-35
• 2.2.6.8 NAC262目的片段与pCPB表达载体的连接35
• 2.2.6.9 miR164目的片段与pCPB121表达载体片段的连接35-36
• 2.2.7 马铃薯的遗传转化36-38
• 2.2.7.1 农杆菌感受态细胞的制备36
• 2.2.7.2 表达载体pCPB-NAC262和pCPB121-miR164农杆菌感受态细胞的转化36-37
• 2.2.7.3 农杆菌介导的马铃薯遗传转化37-38
• 2.2.8 转基因植株的检测38-40
• 2.2.8.1 马铃薯基因组DNA的提取38-40
• 2.2.8.2 转化植株NPTⅡ基因的PCR检测40
• 2.2.9 转基因马铃薯植株的抗旱性检测40-41
• 2.2.9.1 PEG胁迫浓度的选择40
• 2.2.9.2 转基因植株的PEG胁迫处理40
• 2.2.9.3 qRT-PCR检测40-41
• 2.2.10 转基因植株生理指标测定41-42
• 第三章 结果与分析42-57
• 3.1 马铃薯miRNA164靶基因预测42-43
• 3.2 靶基因生物信息学分析43-45
• 3.2.1 靶基因进化分析43-44
• 3.2.2 靶基因结构分析44-45
• 3.3 马铃薯NAC262基因的克隆45-47
• 3.3.1 马铃薯试管薯总RNA的提取45
• 3.3.2 NAC262基因的克隆45-46
• 3.3.3 克隆载体pMD-NAC262双酶切验证46-47
• 3.4 ami R164克隆载体的构建47-49
• 3.4.1 amiR164前体片段的PCR扩增47
• 3.4.2 d片段测序分析47-48
• 3.4.3 克隆载体pMD-miR164双酶切验证48-49
• 3.5 马铃薯NAC262基因和miR164植物表达载体的构建49-50
• 3.5.1 表达载体pCPB-NAC262双酶切验证49
• 3.5.2 表达载体pCPB121-miR164双酶切验证49-50
• 3.6 马铃薯遗传转化50-51
• 3.6.1 马铃薯试管薯的诱导50-51
• 3.6.2 农杆菌介导的马铃薯遗传转化51
• 3.7 转化植株NPTⅡ基因的PCR检测51-52
• 3.8 qRT-PCR分析52-55
• 3.8.1 NAC262基因组织特异性表达分析52-53
• 3.8.2 PEG胁迫下转基因马铃薯植株NAC262基因表达量分析53-55
• 3.9 转基因植株生理指标测定55-57
• 第四章 讨论与展望57-60
• 4.1 讨论57-58
• 4.2 结论58-59
• 4.3 展望59-60
• 参考文献60-65
• 致谢65-66
• 作者简介66-67
• 导师简介67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨致荣,王兴春,李西明,杨长登;高等植物转录因子的研究进展[J];遗传;2004年03期

  本文关键词：马铃薯miRNA164及其靶基因功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：392565