结缕草中盐胁迫响应基因的克隆与功能研究

发布时间：2017-05-26 03:00

  本文关键词：结缕草中盐胁迫响应基因的克隆与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：我国盐碱土地面积大,分布广,水资源短缺,水污染严重,因此需要提高植物的抗旱耐盐碱能力来适应我国水资源缺乏以及盐碱土面积大分布广的现状。结缕草是一种被广泛应用的抗旱耐盐碱能力强的暖季型草坪草,因此,本研究从结缕草盐胁迫条件下的转录组数据库里筛选和克隆响应盐胁迫的基因进行研究,希望对提高植物耐盐性提供一定的理论基础,同时为通过生物技术提高植物耐盐碱能力提供候选基因。在本研究中,通过RT-PCR和qRT-PCR技术,从结缕草盐胁迫条件下的转录组数据库里被注释为ERF类的unigenes里筛选得到4个基因,然后以结缕草cDNA为模板,通过RACE技术克隆获得了3个基因(ZjRAP2-11、ZjERF7和ZjERF10)的全长cDNA;此外,通过与其他物种同源基因的比对和验证,克隆得到了结缕草ZjCCS基因的完整ORF框序列。最后,分别对这4个基因进行研究,4个基因的研究结果如下：通过RACE技术获得ZjERF10的全长cDNA 767 bp,其中,5'UTR 117 bp,3' UTR 215 bp, ORF长435 bp,编码145个氨基酸,blastp比对没有检测到保守的结构域,亚细胞定位结果显示该基因是一个非核定位的基因。生物信息学分析显示：该蛋白为不稳定的亲水性脂溶蛋白,具有跨膜区段,但不具有信号肽。qRT-PCR结果显示：在盐处理4 h之内该基因在叶片与根系中均表达上调,但表达模式不同,该基因不仅受到盐胁迫的诱导,对于ABA、乙烯等其他非生物胁迫也会响应表达上调。该基因过表达转入禾本科模式植物水稻,与野生型相比,转基因植株出现严重败育、结实率显著下降的表型;在浸种相同时间的条件下, T0代种子萌发早于野生型；培养相同时间,转基因植株的T1代幼苗地上部分和地下部分均矮于野生型；在250 mM·L-1 NaCl处理5 h条件下,T1代转基因植株的耐盐性强于野生型。因此,推测该基因可能是一个编码离子通道类蛋白的基因,在植物生长发育过程中起副调控作用,在植物响应非生物胁迫过程中起正调控作用。通过RACE技术克隆得到ZjRAP2-11基因的全长cDNA 1269 bp,其中5’UTR 92bp,3'UTR 262 bp, ORF长915 bp,编码305个氨基酸,具有AP2超家族的保守结构域,与谷子、玉米、水稻等其他物种中预测的响应乙烯的转录因子RAP2-11-like相似度很高,亚细胞定位结果显示该基因定位于细胞核中；RACE技术克隆得到结缕草ZjERF7基因的全长cDNA 577 bp,其中5'UTR 157 bp,3'UTR 159 bp,ORF长261 bp,编码87个氨基酸,在NCBI中没有检测到保守结构域,NCBI数据库中只有2个基因的氨基酸序列可以与之比对上,但是相似度不高,只有33%,亚细胞定位结果显示该基因在细胞质和细胞核中均存在。生物信息学分析结果推测ZjAP2-11基因编码的蛋白为不稳定的亲水性脂溶蛋白,不具有跨膜区段；2jERF7基因编码的蛋白为不稳定的亲水性脂溶蛋白,具有跨膜区段。qRT-PCR结果显示,ZjRAP2-11和ZjERF7在ABA、乙烯、Air Dry和Cool 4种非生物胁迫均会表达上调,但是,在AirDry胁迫下,ZjRAP2-11的表达量上升不明显,同时,根系和叶片中的ZjRAP2-11和ZjERF7对于盐胁迫均会做出响应表达上调,但是表达模式不同,因此认为ZjRAP2-11和ZjERF7基因在结缕草响应非生物胁迫过程中发挥作用。为了解Cu/Zn超氧化物歧化酶分子伴侣基因(CCS)在结缕草非生物胁迫过程中的表达调控机制,以结缕草转录组数据库为依据,结缕草cDNA为模板,通过RT-PCR技术,克隆了924 bp结缕草ZjCCS核酸序列,编码一个含有307个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示：该蛋白稳定的疏水性脂溶蛋白,具有跨膜区段；与小米、玉米、甘蔗和水稻具有较高的同源性,含有植物CCS蛋白所特有的3个保守结构域。qRT-PCR结果显示,在盐胁迫条件下,ZjCCS基因的表达量呈现先上升后下降的趋势,在4 h表达量达到最大值,相对于盐胁迫,干旱胁迫和重金属胁迫对ZjCCS基因的表达量影响不大,推测ZjCCS基因在结缕草响应盐胁迫过程中发挥作用。
【关键词】：结缕草 基因克隆 生物信息学分析 非生物胁迫 转基因
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S688.4
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1. 引言10-18
• 1.1. 研究背景10-16
• 1.1.1. 土壤盐碱化的危害10
• 1.1.2. 植物对盐胁迫的感受机制10-11
• 1.1.3. 根系中响应盐胁迫的基因调控11-12
• 1.1.4. Na~+和K~+的运输网络12-13
• 1.1.5. NHX和SOS在维持细胞质中低Na~+的作用13-14
• 1.1.6. HKT是植物耐盐和Na~+由根系向上运输的主要参与者14-16
• 1.1.7. 结缕草基因的研究进展16
• 1.2. 研究的目的与意义16-17
• 1.3. 研究内容与技术路线17-18
• 2. 结缕草盐胁迫响应基因的克隆与筛选18-34
• 2.1. 材料与方法18-28
• 2.1.1. 实验材料18-20
• 2.1.2. 实验方法20-28
• 2.2. 结果与分析28-32
• 2.2.1. PCR扩增28-29
• 2.2.2. qRT-PCR验证29-30
• 2.2.3. RACE全长克隆30-32
• 2.3. 讨论与结论32-34
• 3. 结缕草ZjERF10基因的克隆与功能研究34-56
• 3.1. 材料与方法34-41
• 3.1.1. 实验材料34-35
• 3.1.2. 试验方法35-41
• 3.2. 结果与分析41-53
• 3.2.1. 结缕草ZjERF10基因的RACE克隆41-42
• 3.2.2. 结缕草ZjERF10基因预测蛋白的理化性质与结构特征分析42-43
• 3.2.3. 结缕草ZjERF10基因的亚细胞定位43
• 3.2.4. 结缕草ZjERF10基因过表达载体的构建与水稻遗传转化43-46
• 3.2.5. 结缕草ZjERF10基因对非生物胁迫的响应46-48
• 3.2.6. 结缕草ZjERF10基因过表达转基因水稻的表型及功能观察48-53
• 3.3. 讨论与结论53-56
• 4. 结缕草ZjERF1基因的克隆与表达分析56-66
• 4.1. 材料与方法56
• 4.1.1. 实验材料56
• 4.1.2. 试验方法56
• 4.2. 结果与分析56-64
• 4.2.1. 结缕草ZjERF1基因的RACE克隆56-58
• 4.2.2. 结缕草ZjERF1基因预测蛋白的理化性质及结构特征分析58
• 4.2.3.结缕草ZjRAP2/11/基因氨基酸序列的同源性比对和进化树分析58-60
• 4.2.4. 结缕草ZjERF1基因的亚细胞定位60-61
• 4.2.5. 结缕草ZjERF1对非生物胁迫的响应61-64
• 4.3. 讨论与结论64-66
• 5. 结缕草ZjERF7基因的克隆与表达分析66-74
• 5.1. 材料与方法66
• 5.1.1. 实验材料66
• 5.1.2. 试验方法66
• 5.2. 结果与分析66-72
• 5.2.1. 结缕草ZjERF7基因的RACE克隆66-67
• 5.2.2. 结缕草ZjERF7基因预测蛋白的理化性质与结构特征分析67-68
• 5.2.3. 结缕草ZjERF7基因的亚细胞定位68-69
• 5.2.4. 结缕草ZjERF7基因对非生物胁迫的响应69-72
• 5.3. 讨论与结论72-74
• 6. 结缕草ZjCCS基因的克隆与表达分析74-86
• 6.1. 材料与方法74-75
• 6.1.1. 实验材料74
• 6.1.2. 实验方法74-75
• 6.2. 结果与分析75-83
• 6.2.1. 结缕草ZjCCS基因的克隆75-78
• 6.2.2. 结缕草ZjCCS蛋白理化性质与结构特征分析78
• 6.2.3. 结缕草ZjCCS基因氨基酸序列的同源性和进化树分析78-82
• 6.2.4. 结缕草ZjCCS基因表达分析82-83
• 6.3. 讨论与结论83-86
• 6.3.1. ZjCCS蛋白功能预测83-85
• 6.3.2. 盐、干旱和重金属胁迫下结缕草ZjCCS基因的差异表达85-86
• 7. 结论与展望86-88
• 7.1. 全文总结86
• 7.2. 研究展望86-88
• 参考文献88-98
• 个人简介98-100
• 导师简介100-102
• 获得成果目录102-104
• 致谢104

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