水稻OsFRK1与OsFRK2基因CRISPR敲除突变体的构建

发布时间：2024-04-20 23:03

　　为揭示水稻果糖激酶(OsFRK)家族基因的生物学功能,采用CRISPR/Cas9技术,成功创建了2个已鉴定了的水稻OsFRK家族基因的敲除突变体;获得28株OsFRK1的T₀代转基因植株,其转基因阳性率、突变率与纯合突变率分别为100%、46.43%和10.71%;获得14株OsFRK2的T₀代转基因植株,其转基因阳性率、突变率与纯合突变率分别为92.86%、92.86%和21.43%;T₀代敲除纯合突变体中目的蛋白质的功能结构域均发生不同程度的破坏。

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【部分图文】：

图1OsFRK1和OsFRK2的CRISPR/Cas9敲除靶点序列与位置

在Phytozome数据库中下载OsFRK1和OsFRK2的基因序列，利用CRISPR–P和CRISPR–GE在线网站设计最佳的靶点(图1)，在OsFRK1基因的第1个外显子上设计了1个敲除靶点，由OsU6b启动；在OsFRK2基因的第1个外显子上设计了2个敲除靶点，分....

图2水稻OsFRK1和OsFRK2的CRISPR敲除表达载体构建

参考MA等[14]的方法，首先成功构建了sgRNA表达盒，其2轮巢式PCR产物电泳结果(图2–A、图2–B)显示，第2轮PCR产物OsFRK1–OsU6b–gRNA、OsFRK2–OsU6a–gRNA、OsFRK2–OsU6b–gRNA电泳条带大小与预期的基本....

图3水稻OsFRK1和OsFRK2T0代转基因植株的获得过程

成功获得CRISPR/Cas9敲除表达载体后，利用冻融法将其转化至根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞中，经农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，获得T0代转基因水稻植株(图3)。最终获得28株OsFRK1基因的T0代转基因植株和14株OsFRK2基因的T0代转基因植株。这些转基因植....

图4T0代转基因水稻植株的PCR检测

在转基因幼苗移栽至大田15d后，提取其叶片基因组DNA，对其转基因植株的阳性率和敲除突变情况进行鉴定。对潮霉素抗性基因(HPT)进行PCR扩增条带检测(图4)，其中HPT扩增片段大小为733bp；若无条带，则表明无T–DNA插入。对T0代转基因植株进行分析，结果(表2)显示，2....

本文编号：3960059