RFWD3基因重组慢病毒表达载体的构建及RFWD3蛋白在宫颈癌细胞中的功能验证

发布时间：2024-04-27 03:52

　　目的构建E3泛素化连接酶环指与WD重复结构域蛋白(RING finger and WD repeat domain,RFWD3)的慢病毒表达载体,研究RFWD3对宫颈癌细胞增殖与迁移能力的影响。方法以宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板扩增RFWD3基因片段,利用DNA重组技术,将上述片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(简称pCDH)中,构建pCDH-RFWD3重组真核表达质粒。经酶切及测序验证准确后,采用三质粒慢病毒包装系统包装RFWD3病毒,通过梯度稀释法感染人胚肾上皮细胞(293T)检测病毒滴度。随后采用RFWD3慢病毒液感染宫颈癌HeLa细胞,运用Western blot实验检测慢病毒转导后HeLa细胞中RFWD3蛋白的表达水平,进一步通过CCK-8和细胞划痕实验检测过表达RFWD3蛋白对HeLa细胞增殖与迁移能力的影响。结果可表达RFWD3蛋白的pCDH-RFWD3慢病毒载体获成功构建。包装RFWD3慢病毒,建立稳定表达RFWD3蛋白的宫颈癌HeLa细胞系。RFWD3慢病毒转导后的HeLa细胞与对照细胞相比,其细胞增殖与迁移能力显著增强(P<...

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【部分图文】：

图1PCR扩增RFWD3基因后的核酸电泳图

对稳定的、成功感染后的pCDH及pCDH-RFWD3HeLa细胞,采用CCK-8法进行细胞增殖能力的测定。结果显示,从第3天开始,过表达RFWD3蛋白的HeLa细胞增殖能力增强(P<0.05)。见图8。划痕实验结果表明,过表达RFWD3的HeLa细胞在细胞接种24h后,其迁....

图2质粒pCDH-RFWD3双酶切鉴定的核酸电泳图

图1PCR扩增RFWD3基因后的核酸电泳图图3RFWD3重组质粒共转染293T细胞后GFP的表达(×100)

图3RFWD3重组质粒共转染293T细胞后GFP的表达(×100)

图2质粒pCDH-RFWD3双酶切鉴定的核酸电泳图图4不同稀释度的RFWD3慢病毒感染293T细胞后GFP的表达(×100)

图4不同稀释度的RFWD3慢病毒感染293T细胞后GFP的表达(×100)

图3RFWD3重组质粒共转染293T细胞后GFP的表达(×100)图5不同稀释度的pCDH慢病毒感染293T细胞后GFP的表达(×100)

本文编号：3965314