7α-HSDH的基因筛

发布时间：2024-12-01 00:25

　　熊胆是一种传统的珍稀药材,是棕熊或黑熊的胆囊。熊去氧胆酸（UDCA）是熊胆的主要药用成分,其与牛磺酸结合形成牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）,TUDCA被广泛应用于各种肝胆疾病的治疗。目前TUDCA主要是通过熊胆引流或化学合成的方法来获取,但这两种方法对生态和环境不友好。随着生物技术和工程技术的融合发展,应用生物催化技术来大规模制备TUDCA将成为可能。本课题组前期发现,在体外,可以以7α-HSDH为催化剂催化TCDCA发生7α-脱氢生成T7-KLCA,再进一步以7β-HSDH为催化剂催化T7-KLCA加氢而生成TUDCA。因此,7α-HSDH是体外应用生物催化技术制备TUDCA的关键酶之一。7α-HSDH的热稳定性和催化活性是决定其能否适应工业化生产的关键因素。本文以获取热稳定性好,催化活性高的7α-HSDH为目的,在黑熊肠道微生物宏基因组数据库中获得了一个新的7α-HSDH（命名为St-2-2）,系统的研究了St-2-2的酶学性质。基于生物信息学分析,进一步对其羧基端进行了分子改造,获得了热稳定性与活性都提高的突变体,并初步探讨了突变体I255Q热稳定性提高的原因。本研究扩展了7α-HS...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
缩略表
1 绪论
    1.1 课题研究背景
    1.2 7α-HSDH研究现状
    1.3 科学问题的提出及研究意义
    1.4 研究内容
    1.5 技术路线
2 基于宏基因组数据挖掘新的7α-HSDH
    2.1 引言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 实验仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 7α-HSDH基因挖掘
        2.3.2 同源性及进化树分析
        2.3.3 粪便样品的采集
        2.3.4 黑熊粪便总DNA提取
        2.3.5 目的基因的克隆
        2.3.6 PCR产物鉴定与回收
        2.3.7 pGEX-6p-2-St-2-2 重组载体的构建
        2.3.8 St-2-2 的表达、纯化
        2.3.9 粒径排阻色谱分析蛋白分子量
        2.3.10 MALDI-TOF-MS质谱测定蛋白分子量
        2.3.11 St-2-2 的酶活测定
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 7α-HSDH基因挖掘、筛选与克隆
        2.4.2 7α-HSDH基因的重组载体构建及重组蛋白的表达纯化
        2.4.3 同源性及进化树分析结果
        2.4.4 粒径排阻色谱分析、MALDI-TOF-MS质谱测定蛋白分子量
        2.4.5 酶活检测结果
    2.5 本章小结
3 St-2-2酶学性质研究
    3.1 引言
    3.2 材料与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 St-2-2的表达与纯化
        3.3.2 影响酶活的因素
        3.3.3 酶促动力学参数检测
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 St-2-2 最适p H值
        3.4.2 St-2-2 最适温度
        3.4.3 St-2-2 热稳定性研究
        3.4.4 金属离子对St-2-2 酶活的影响
        3.4.5 酶促动力学参数检测
    3.5 本章小结
4 St-2-2 的羧基端分子改造
    4.1 引言
    4.2 材料与仪器
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 突变引物的设计
        4.3.2 突变基因聚合酶链式反应
        4.3.3 PCR产物鉴定与回收纯化
        4.3.4 突变载体的构建
        4.3.5 突变体表达
        4.3.6 突变体酶活力测定
        4.3.7 突变体热稳定性研究
        4.3.8 St-2-2 与突变体Tm值测定
        4.3.9 突变体I255Q与野生型St-2-2 的同源建模结构预测
        4.3.10 圆二色谱法测定St-2-2 和突变型I255Q二级结构
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 突变体基因突变位点信息
        4.4.2 突变体基因的克隆
        4.4.3 突变基因的重组载体构建及重组蛋白的表达纯化
        4.4.4 突变体酶活检测
        4.4.5 突变型St-2-2 的热稳定性研究
        4.4.6 野生型St-2-2 与突变型St-2-2的Tm值检测
        4.4.7 野生型St-2-2 与突变体St-2-2 的同源建模结构预测
        4.4.8 野生型St-2-2 与突变型St-2-2 二级结构分析
    4.5 本章小结
5 全文总结及后续工作建议
    5.1 全文主要结论
    5.2 后续工作建议
参考文献
附录
    A.作者在攻读学位期间发表的论文目录
    B.作者在攻读学位期间取得的科研成果目录
    C.学位论文数据集
致谢



本文编号：4013250