延边流行株犬瘟热病毒H基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

发布时间：2017-06-07 16:12

本文关键词：延边流行株犬瘟热病毒H基因的原核表达及间接ELISA方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：犬瘟热(Canine Distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus, CDV)感染而引起的急性传染病,具有接触性强、发病率和死亡率高等特点,并可引起机体免疫抑制,是危害犬科类动物生命较为严重的传染病之一,严重制约了我国养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护业的发展。因此,建立一种快速、高效的特异性检测方法对于该病的防控具有十分重要的意义。本试验采集延边地区自然感染犬瘟热病毒患病犬的组织病料,提取CDV全基因组,利用RT-PCR方法扩增CDV-H基因,将其克隆至pMD18-T simple vector载体,构建重组克隆质粒pMD18T-CDV-H,并将pMD18T-CDV-H与pGEX-4T-1载体经BamH I和Xho I双酶切,构建重组表达质粒pGEX-CDV-H,转化至BL21(DE3)表达菌株,通过对不同温度、IPTG浓度、Amp+浓度和诱导时间等条件的优化进行重组蛋白的表达,利用SDS-PAGE凝胶电泳对表达产物进行分离鉴定。将诱导表达出的重组蛋白进行纯化,利用Western-blot方法分析纯化蛋白的反应原性,并将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备小鼠抗CDV蛋白多克隆抗体,检测其抗体效价,并利用纯化抗原建立间接ELISA方法。结果显示,CDV-H基因全长约为1824 bp,编码607个氨基酸,该序列与近几年GenBank中收录的国内外9株CDV-H基因核苷酸序列同源性为88.9-99.8%,氨基酸序列同源性为85.8-99.5%。经SDS-PAGE鉴定,重组融合蛋白的分子量约为103 Ku,以包涵体形式存在。纯化蛋白经Western-blot分析鉴定,具有良好的反应原性,免疫BALB/c小鼠可诱导其产生抗CDV-H抗体,抗体效价为1：64,证明该重组表达蛋白具有良好的免疫原性。通过对间接ELISA方法最适条件的筛选,得到重组蛋白最佳包被浓度为6.88μg/mL,血清最佳稀释度为1：100,抗原最佳包被条件为4℃过夜,血清最佳作用条件为37℃1h,3%脱脂乳的最佳封闭条件为37℃3 h,辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG的最佳稀释倍数为1：5000,最佳作用条件为37℃1 h,底物最佳显色条件为37℃15 mmin。通过对特异性试验、重复性试验、对比试验和临床样本检测结果的分析,证实本试验建立的间接ELISA方法行之有效,可应用于临床检测。本试验为延边地区犬瘟热病毒疫苗免疫水平的监测提供了一种简便快捷的方法,并为进一步研究犬瘟热病毒H基因的生物学特性奠定了基础。
【关键词】：犬瘟热病毒 H基因 原核表达 ELISA
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

摘要6-7
Abstract7-11
前言11-20
1 犬瘟热的研究进展11-16
1.1 犬瘟热的发现与流行病学特点11-12
1.2 病原学12-14
1.2.1 犬瘟热病毒的分类地位12
1.2.2 犬瘟热病毒的形态和理化特征12
1.2.3 犬瘟热病毒的培养特性12-13
1.2.4 犬瘟热病毒的分子生物学特征13-14
1.3 致病机理14-15
1.4 临临床症状和病理变化15
1.5 免疫防控研究15-16
2 犬瘟热病毒检测方法的研究进展16-19
2.1 病毒的分离16
2.2 动物回归试验16
2.3 包涵体检查16-17
2.4 电镜检查17
2.5 免疫学检测17-18
2.5.1 血清中和试验17
2.5.2 免疫组化技术17-18
2.5.3 免疫荧光技术18
2.5.4 酶联免疫吸附试验18
2.5.5 胶体金免疫层析检测18
2.6 分子生物学检测18-19
2.6.1 核酸杂交技术18-19
2.6.2 RT-PCR技术19
2.6.3 环介导等温扩增19
3 研究的目的及意义19-20
材料与方法20-36
1 材料20-24
1.1 病料20
1.2 试验动物20
1.3 载体20
1.4 主要试剂20-21
1.5 试验所用溶液及其配制21-23
1.5.1 分子克隆所需溶液的配制21
1.5.2 琼脂糖凝胶电泳所需溶液配制21
1.5.3 SDS-PAGE电泳所需溶液配制21-22
1.5.4 蛋白纯化所需溶液配制22-23
1.5.5 Western-blot及ELISA所需溶液配制23
1.6 主要仪器设备23-24
2 方法24-36
2.1 引物的设计与合成24
2.2 犬瘟热病毒全基因组RNA的提取24-25
2.3 犬瘟热病毒H基因的扩增25
2.4 目的基因的纯化回收25-26
2.5 目的基因的克隆与鉴定26-29
2.5.1 CDV-H基因与pMD-18T simple vector连接26-27
2.5.2 重组克隆的转化27
2.5.3 重组克隆质粒的提取27-28
2.5.4 重组克隆质粒的PCR鉴定28
2.5.5 重组质粒的酶切鉴定28-29
2.5.6 序列测定29
2.6 重组表达质粒的构建及鉴定29-30
2.6.1 目的基因和pGEX-4T-1表达载体的酶切与回收29
2.6.2 目的片段与表达载体的连接29-30
2.6.3 连接产物的转化及质粒的提取30
2.6.4 重组表达质粒的PCR鉴定和酶切鉴定30
2.6.5 表达质粒的序列测定30
2.7 重组表达蛋白的诱导表达30-33
2.7.1 重组蛋白表达条件的优化30-31
2.7.2 重组蛋白可溶性分析31
2.7.3 重组表达蛋白的纯化31-32
2.7.4 重组表达蛋白的Western-blot分析32
2.7.5 多克隆抗体的制备32-33
2.7.6 多克隆抗体效价的检测33
2.8 重组蛋白间接ELISA方法的建立33-36
2.8.1 纯化抗原最佳包被浓度的筛选与血清最佳稀释度的筛选33
2.8.2 纯化抗原最佳包被条件的筛选33-34
2.8.3 最适封闭液的筛选和最佳封闭时间的筛选34
2.8.4 血清最佳作用时间的筛选34
2.8.5 酶标二抗最佳作用时间和最佳稀释度的筛选34
2.8.6 底物最适显色时间的筛选34
2.8.7 阳性和阴性临界值的确定34-35
2.8.8 特异性试验35
2.8.9 重复性试验35
2.8.10 间接ELISA方法与免疫胶体金方法的比较试验35
2.8.11 临床样本检测35-36
结果36-52
1 犬瘟热病毒H基因的RT-PCR扩增36
2 pMD18T-CDV-H重组克隆质粒的鉴定36-38
2.1 重组质粒的PCR鉴定36-37
2.2 重组质粒的双酶切鉴定37-38
3 重组质粒的序列测定及进化分析38
4 重组质粒的PCR鉴定38-40
4.1 重组质粒的PCR鉴定38-39
4.2 重组质粒的双酶切鉴定39-40
5 重组质粒的诱导表达40
6 重组表达蛋白的可溶性分析40-41
7 重组表达蛋白的纯化41-42
8 重组表达蛋白的Western-blot分析42
9 多克隆抗体效价的测定42
10 间接ELISA检测方法的建立42-52
10.1 纯化抗原最佳包被浓度的筛选与血清最佳稀释度的筛选42-43
10.2 纯化抗原最佳包被条件的筛选43-44
10.3 最适封闭液的筛选和最佳封闭时间的筛选44-45
10.4 血清最佳作用时间的筛选45-46
10.5 酶标二抗最佳作用时间和最佳稀释度的筛选46-47
10.6 底物最适显色时间的筛选47-48
10.7 阳性和阴性临界值的确定48
10.8 特异性试验结果48-49
10.9 重复性试验结果49-50
10.10 间接ELISA方法与免疫胶体金方法的比较试验结果50-51
10.11 临床样本检测结果51-52
讨论52-56
结论56-57
参考文献57-61
致谢61-62
作者简介62

【相似文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 闫喜军;柴秀丽;罗国良;王凤雪;田宏宇;张海玲;易立;邵西群;;貉犬瘟热病毒的分离与鉴定[J];特产研究;2006年04期

2 Pillet S;邱文英;;犬瘟热病毒对被感染免疫细胞的细胞凋亡过程的选择性抑制[J];中国畜牧兽医;2009年07期

3 金耀忠;朱苗红;李义;;犬瘟热病毒的分离与初步鉴定[J];上海畜牧兽医通讯;2009年06期

4 刘玉秀;高玉伟;李天松;王磊;于志君;李林;张钊伟;朱晓文;冯娜;黄耕;杨松涛;王铁成;夏咸柱;;犬瘟热病毒引起啮齿类动物肥胖症的机制研究进展[J];动物医学进展;2010年12期

5 耿志贤,田克恭,李钟铎;犬瘟热病毒的分子生物学研究进展[J];中国兽医杂志;1997年02期

6 郭爱珍,陆承平;犬瘟热病毒细胞膜受体的鉴定[J];病毒学报;2000年02期

7 韩磊,靳兴军,郭峰,梁明珍,}谖，

本文编号：429590

资料下载

论文发表

支付宝下载

Download by Alipay
微信下载

Download by Wechat
会员下载

Download by Member

本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/429590.html

上一篇：拟南芥PXY及同源基因的表达分析
下一篇：中国小麦生产品种抗条锈性的评价及基因检测

论文发表

·知网|万方|维普|龙源|省级|国家级|科技核心|北大核心|南大核心CSSCI|EI|SCI|SSCI|