一株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因的遗传进化分析

发布时间：2017-06-08 21:06

  本文关键词：一株伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因的遗传进化分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV;Aujeszky’disease virus,ADV),属于疱疹病毒科(Herpesvirdae)α-疱疹病毒亚科,PRV可感染多种家畜及野生动物,其中猪最易感,也最为严重,是该病毒的自然宿主和贮存者。PRV可造成严重的经济损失,被我国列为2类传染病。当前,国内使用的PRV疫苗有猪伪狂犬弱毒疫苗、野毒灭活苗和基因工程缺失疫苗。疫苗的广泛使用有效地控制了PR的流行,部分国家依靠疫苗已经逐渐消灭了PR,我国也在2010年前基本控制了PR。但自2011年以来,童光志、田志军、李学伍和陈焕春等相继报道了在吉林、黑龙江、河南和山东等多个省份免疫猪群暴发PR的病例。发病猪场公猪出现体温升高、阴囊炎,母猪屡配不孕或者配种后产弱仔、死胎或流产,仔猪腹泻、伴发神经症状和高死亡率。张青占、赵鸿远和潘宵等分别从河南、黑龙江、江苏和吉林等多个省份发病的免疫猪场中分离到PRV,且实验证明部分分离株为变异PRV强毒株,表明现有疫苗不能完全保护免疫猪群,仍有暴发PR疫情的可能。近几年,陕西省猪群PR发生的频率呈上升趋势,为分析陕西省猪群PR的流行情况,本研究对陕西省12家规模化猪场进行了采样和PRV检测,并对其中某疑似发生PR的猪场进行了实验室诊断和病毒分离鉴定及遗传进化分析,研究内容和结果如下:1.陕西省规模化猪场PRV感染状况的调查。选取陕西省具有地域代表性的12个PR免疫过的猪场,随机采取经产母猪血样,分离血清,共获得血清样品78份,使用PCR和ELISA PRV-g E抗体检测方法对血清样品进行检测。结果显示,4个猪场PRV PCR检测阳性,占抽检猪场的33.33%;14份血清PRV PCR检测阳性,占检测样品数的17.95%;5个猪场PRV g E抗体阳性,占抽检猪场的41.46%;17份血清PRV g E抗体阳性,占检测样品数的21.79%。2.发病场猪PR的诊断及PRV的分离鉴定。2015年10月陕西某猪场暴发疑似PR的疫情,采取发病仔猪的血液、脑、脊髓、肝脏和脾脏,通过ELISA、PCR、动物试验等对病例进行实验室诊断,最终确定为PRV感染。将病料处理后接种BHK-21细胞进行PRV分离,经连续6次传代,细胞出现病变规律稳定,获得效价稳定的病毒,测定TCID50为10-5.386/0.1m L。通过PCR检测、家兔接种、鸡胚接种等试验对病毒进行了进一步鉴定,鉴定为PRV,将其命名为SX-10-2015。3.PRV SX-10-2015株g E基因的扩增与序列分析。为进一步研究PRV陕西分离株SX-10-2015的遗传进化地位,对分离株g E基因进行了扩增和测序,将获得的g E基因序列与近些年来流行的PRV毒株、本实验室2006年分离的WG株、以及国内外经典PRV毒株的g E基因序列进行了同源性比对分析,并构建了遗传进化树。结果发现分离株SX-10-2015与国内近年的PRV流行毒株GD-4-2013株、JN和WZ株遗传距离较近,属同一分支;与国外Kaplan、Ni A3和00V7分离株遗传距离较远,属于不同分支;分离毒株SX-10-2015的g E基因编码氨基酸同源性分析显示与GD-4-2013分离株和He N1分离株同源性分别为99.7%和99.3%;而其与Ea和FA PR疫苗株g E氨基酸同源性分别为99.3%、98.8%和98.8%。以上研究结果提示,陕西省规模化猪场PRV阳性率和猪个体PRV阳性率均较高;分离的SX-10-2015株g E毒力基因核苷酸和氨基酸序列与近年报道的变异株同源性较高,遗传进化地位更近,但其氨基酸同源性与国内疫苗毒株Ea和FA同源性也高达98.8%,疫苗免疫能否为SX-10-2015株提供免疫保护仍需进一步研究。
【关键词】：猪伪狂犬病病毒 毒力 遗传进化 gE基因
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 伪狂犬病综述11-21
• 1.1 伪狂犬病简介11-12
• 1.1.1 病原简介11
• 1.1.2 伪狂犬病的临床症状11-12
• 1.1.3 伪狂犬病的病理变化12
• 1.1.4 伪狂犬病的流行病学12
• 1.2 伪狂犬病的诊断12-13
• 1.3 PRV的分子生物学特征13-14
• 1.3.1 狂犬病病毒的分子结构13
• 1.3.2 主要基因及编码的蛋白13-14
• 1.4 PRV的理化特性14-15
• 1.5 伪狂犬病病毒的致病机理15
• 1.6 PRV疫苗研究进展15-17
• 1.6.1 传统疫苗16
• 1.6.2 伪狂犬病基因缺失疫苗16-17
• 1.6.3 重组疫苗17
• 1.6.4 亚单位疫苗17
• 1.7 伪狂犬病的综合防控措施17-19
• 1.7.1 美国伪狂犬病根除计划的经验18
• 1.7.2 荷兰伪狂犬病根除计划的经验18-19
• 1.7.3 我国伪狂犬病根除计划的研究19
• 1.8 本研究的目的意义19-21
• 第二章 陕西省部分规模化猪场伪狂犬病病毒感染状况的调查21-25
• 2.1 试验仪器和试剂21
• 2.2 方法21-23
• 2.2.1 陕西省部分猪场猪PRV感染状况的调查21
• 2.2.2 血清样品的采集21
• 2.2.3 样品的实验室检测21-23
• 2.3 结果23-24
• 2.4 讨论24
• 2.5 小结24-25
• 第三章 陕西省发病猪场猪PRV的分离鉴定25-37
• 3.1 材料25-26
• 3.1.1 主要试剂25
• 3.1.2 主要仪器25-26
• 3.2 方法26-28
• 3.2.1 病料采集26
• 3.2.2 血清学抗体检测26
• 3.2.3 病原学检测26
• 3.2.4 细菌学试验26
• 3.2.5 动物试验26-27
• 3.2.6 阳性病料接种BHK-21 细胞27
• 3.2.7 细胞培养物的鉴定27-28
• 3.3 结果28-35
• 3.3.1 剖解及病料的采集28-29
• 3.3.2 血清学抗体检测结果29-30
• 3.3.3 病原学检测结果30
• 3.3.4 细菌学试验30
• 3.3.5 动物试验30-32
• 3.3.6 阳性病料接种BHK-21 细胞32-33
• 3.3.7 细胞培养物的鉴定33-35
• 3.4 讨论35-36
• 3.5 小结36-37
• 第四章 伪狂犬病病毒（SX102015）株g E基因的进化分析37-50
• 4.1 材料和方法37-42
• 4.1.1 毒株、菌株、质粒37
• 4.1.2 主要仪器37-38
• 4.1.3 主要试剂及培养基的配制38-39
• 4.1.4 引物的设计与合成39
• 4.1.5 伪狂犬病病毒DNA的提取39-40
• 4.1.6 伪狂犬病病毒g E全基因的PCR扩增40-41
• 4.1.7 连接和转化41
• 4.1.8 菌落PCR鉴定及阳性克隆的测序41-42
• 4.1.9 测序结果使用分子生物学软件分析42
• 4.2 结果42-47
• 4.2.1 分离株SX102015 株g E基因PCR扩增结果42
• 4.2.2 PRV分离株菌液PCR结果42-43
• 4.2.3 g E基因阳性克隆的测序结果43-44
• 4.2.4 测序结果使用分子生物学软件分析44-47
• 4.3 讨论47-49
• 4.4 小结49-50
• 结论50-51
• 参考文献51-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

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本文编号：433739