转gshB基因油菜毛状根的诱导

发布时间：2017-06-27 20:10

  本文关键词：转gshB基因油菜毛状根的诱导，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：重金属镉(Cd)是生物毒性较强的重金属元素之一,它会随工业“三废”排放到土壤中,并且在土壤一植物系统中迁移,因此Cd污染土壤的修复引起了世界各国的关注。利用植物修复技术进行Cd污染土壤的修复具有良好的应用潜力,而Cd超富集植物是这一技术应用的关键。因此加强对Cd超富集植物的研究是推动植物修复Cd污染环境实际应用的基础。本论文选择生长快、易获得的Cd超富集植物油菜(Brassica campestris L.)作为研究材料,选择编码谷酰半胱氨酸巯基合成酶(GS)的gshB基因作为外源目的基因,希望利用农杆菌介导技术建立转基因的油菜毛状根体系,为研究植物根系与Cd的相互作用提供简便可靠的实验体系。方法：发根农杆菌介导法是植物转基因技术常用的方法之一,本论文利用野生型发根农杆菌和携带gshB基因的发根农杆菌分别转化油菜,获得野生型油菜毛状根和转gshB基因油菜毛状根。为了实现油菜毛状根的诱导并获得较高的转化率,利用正交试验(L8(27))的方法,考查了发根农杆菌菌种(ATCC 11325、ATCC 15834)、油菜外植体(子叶、茎段)、侵染时间(10 min、30min)、激素(2,4-D、NAA)四因素对油菜毛状根诱导的影响。利用热激法将构建的重组pRI101-gshB质粒转入发根农杆菌ATCC11325中,获得改造的含有gshB目的基因的ATCC 11325菌种。利用PCR和RT-PCR技术对转化的毛状根进行鉴定,确定毛状根转化的关键基因rolC和目的基因gshB已经整合到油菜毛状根组织的DNA中。最后对油菜毛状根进行初步的Cd胁迫应激响应研究。将转gshB基因毛状根和野生型毛状根分别置于不含Cd和含50 μmol/L Cd的MS培养基上进行暗培养,7d后取样测定毛状根的生物量、毛状根中过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化、丙二醛(MDA)的含量,并且通过PI染色检测Cd胁迫下的植物细胞膜的通透性。结果：正交实验方差分析结果显示,菌种和侵染时间的交互作用、外植体种类对油菜毛状根的诱导达到显著水平。正交实验结果表明：利用发根农杆菌ATCC11325对预培养48 h的油菜子叶进行转化,转化时间 10 min,同时加入0.3 mg/L的2,4-D激素时,油菜毛状根的转化率可达到73%。PCR扩增结果显示发根农杆菌Ri质粒中的rolC基因已经插入并整合到油菜的植物基因组中,表明成功诱导出了油菜毛状根体系。利用正交试验优化获得的油菜毛状根最佳诱导条件,用含有重组pRI101-gshB质粒的发根农杆菌ATCC 11325侵染油菜子叶,诱导出了转gshB基因的油菜毛状根。PCR结果表明转gshB基因毛状根DNA基因组中含有960 bp左右的gshB基因片段,证明目的片段已经整合到油菜核基因组中。采用RT-PCR反转录油菜RNA获得cDNA序列,PCR结果显示cDNA序列中含有960 bp的目的片段,表明目的基因已经在毛状根中转录,说明成功获得了转gshB基因的油菜毛状根。毛状根的Cd胁迫应激响应的初步实验表明,50 μmol/L的Cd对油菜野生型毛状根和转gshB毛状根的生长都有一定的抑制作用；油菜野生型毛状根和转gshB毛状根中SOD、POD酶的活性都有一定程度的升高,MDA的含量都增大,PI染色程度加深。同时,在50 、μmol/L的Cd处理下,转gshB毛状根中SOD和POD酶活性的升高比例高于野生型毛状根,MDA的量和PI染色程度都低于野生型毛状根。这可能是由于转入的gshB基因提高了油菜毛状根螫合Cd的能力,减轻了毛状根被Cd毒害的程度。转gshB基因油菜毛状根体系的建立,可为后续利用油菜毛状根探究植物根系富集Cd的机制提供较好的实验研究体系。
【关键词】：油菜 镉重金属超富集植物 正交试验 毛状根 gshB
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 1 引言13-19
• 1.1 镉污染环境修复现状13-14
• 1.1.1 重金属镉的危害13
• 1.1.2 传统方法在修复重金属镉污染环境中的应用13
• 1.1.3 植物修复技术的应用13-14
• 1.2 植物组织细胞在修复环境污染研究中的应用14
• 1.3 植物耐受重金属镉的机制14-16
• 1.3.1 植物螯合肽的螯合原理14-15
• 1.3.2 gshB基因富集重金属镉的分子机制15
• 1.3.3 膜转运蛋白转运作用15-16
• 1.4 重金属镉超富集植物转基因毛状根改造研究16-17
• 1.5 油菜在修复镉污染土壤中的研究17
• 1.6 课题研究目标和意义17-19
• 1.6.1 课题研究目标17
• 1.6.2 课题研究意义17-19
• 2 实验材料和方法19-30
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 菌种和质粒19
• 2.1.3 实验试剂与试剂盒19
• 2.1.4 培养基和试剂的配置19-20
• 2.1.5 实验仪器20-21
• 2.2 实验方法21-30
• 2.2.1 菌株及其培养21
• 2.2.2 无菌苗的获得21-22
• 2.2.3 毛状根的诱导和培养22
• 2.2.4 正交试验设计22-23
• 2.2.5 油菜毛状根的PCR检测23
• 2.2.6 构建重组质粒pRI101-gshB23-27
• 2.2.7 菌液PCR鉴定转gshB发根农杆菌ATCC1132527
• 2.2.8 转gshB基因毛状根的诱导27
• 2.2.9 转gshB基因毛状根的PCR鉴定27-28
• 2.2.10 转gshB基因毛状根的RT-PCR鉴定28
• 2.2.11 毛状根生长状况的观察和生物量的检测28-29
• 2.2.12 SOD酶和POD酶活性的测定29
• 2.2.13 MDA含量的测定29
• 2.2.14 毛状根的PI染色29-30
• 3 实验结果30-43
• 3.1 油菜毛状根诱导的正交实验结果直观分析30-32
• 3.1.1 不同菌株对油菜毛状根诱导的影响31
• 3.1.2 不同外植体对油菜毛状根诱导的影响31
• 3.1.3 不同侵染时间对油菜毛状根诱导的影响31-32
• 3.1.4 不同外源激素对油菜毛状根诱导的影响32
• 3.2 油菜毛状根诱导的正交实验结果方差分析32-33
• 3.3 油菜毛状根的鉴定33-34
• 3.4 连接产物pRI101-gshB重组质粒双酶切鉴定34-35
• 3.5 菌液PCR鉴定转gshB发根农杆菌ATCC1132535
• 3.6 转gshB基因毛状根的诱导和鉴定35-36
• 3.7 RT-PCR鉴定转gshB基因毛状根36-37
• 3.8 Cd胁迫对毛状根生长和生物量的影响37-39
• 3.9 Cd胁迫对毛状根SOD酶活性的影响39-40
• 3.10 Cd胁迫对毛状根POD酶活性的影响40-41
• 3.11 Cd胁迫对毛状根MDA含量的影响41-42
• 3.12 Cd胁迫下毛状根的PI染色荧光显微结果42-43
• 4 实验结果讨论43-46
• 5 结论46-47
• 参考文献47-49
• 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果49-51
• 学位论文数据集51

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本文编号：491079