过表达关键酶基因对酿酒酵母胁迫耐性的影响

发布时间：2017-06-27 21:15

  本文关键词：过表达关键酶基因对酿酒酵母胁迫耐性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：利用可再生纤维素原料生产燃料乙醇是国内外研究的热点。乙醇工业生产过程中酿酒酵母受到多种环境胁迫条件的影响,包括高浓度乙醇和纤维素水解液中的抑制物等,其中乙酸是纤维素水解液中含量较高的抑制物。胁迫耐受性好的酿酒酵母不仅细胞活性高保证正常生长和乙醇产量,还可缩短发酵周期、降低生产成本。因此,选育高胁迫耐受性的酿酒酵母对提高乙醇发酵效率非常重要。本课题组前期研究发现,添加硫酸锌可以提高絮凝酵母的环境胁迫耐受性,且在乙醇连续发酵过程中,添加硫酸锌的酵母Sod1p、Grx5p、Ycr102cp等酶蛋白表达上调,但这些蛋白在纤维素乙醇生产抑制物耐受性方面的影响还没有深入研究。本论文研究了SOD1、GRX5及YCR102C三个关键酶基因过表达对酿酒酵母乙酸耐性及抑制剂存在条件下胁迫耐性的影响。结果表明,过表达GRX5、YCR102C的重组菌株在含有5g/L乙酸、5mMH2O2、10%乙醇的平板中及42℃高温条件下生长优于对照菌株,而SOD1过表达菌株在添加锌离子后耐性才高于对照菌株,推测锌添加可提高SOD1酶活性。其次,在5 g/L乙酸胁迫条件下进行乙醇发酵,过表达SOD1, GRX5及YCR102C的重组菌株发酵时间均比对照菌株明显缩短。同时,过表达GRX5及YCR102C菌株的不同抗氧化酶活性,包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶等酶活性分别提高50.7%、34.5%、158%以及6.3%、47.4%和16.0%。同时,在该条件下过表达GRX5及YCR102C都影响了金属离子的吸收,胞内K及Fe含量均得到提高。另外,研究了过表达GRX5及YCR102C对模拟纤维素水解液发酵的影响,结果显示,重组菌株GRX5-Sc4126的乙醇产率提高了61.4%,达到0.62 g/L/h,且过表达菌株比对照菌株具有更快速还原糠醛及5-HMF的能力,糠醛全部消耗时间从对照菌株的84 h缩短到48 h,5-HMF从96 h缩短到60 h：重组菌株YCR102C-Sc4126的乙醇产率提高了36.8%,为0.52 g/L/h,且过表达菌株降解糠醛及5-HMF的时间均缩短了24小时。对YCR102C过表达菌株中关键基因的表达水平与含有空载体的对照菌株进行了比较分析,发现过表达YCR102C的重组菌株中在乙酸胁迫条件下和无胁迫的对照条件下转录调控基因STB5表达均上调,表明过表达该未知功能基因影响了关键转录因子的表达水平。本论文研究结果表明,过表达SOD1, GRX5和YCR102C可用于选育胁迫条件下发酵性能良好的酵母菌株。研究结果为进一步研究胁迫耐性相关基因的作用机理,选育胁迫耐性良好的工业乙醇酵母,提高纤维素乙醇发酵效率提供了参考。
【关键词】：酿酒酵母 SOD1 GRX5 YCR102C 乙酸 环境胁迫耐受性
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ926
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1. 绪论11-26
• 1.1 纤维素乙醇与酿酒酵母11-17
• 1.1.1 纤维素乙醇的生产现状11-12
• 1.1.2 纤维素原料预处理12-16
• 1.1.3 纤维素水解液中抑制物组成16-17
• 1.2 酿酒酵母环境胁迫耐受性17-18
• 1.3 抵抗氧化胁迫的酶学及非酶学机制18-23
• 1.3.1 SOD1基因19-20
• 1.3.2 GRX5基因20-21
• 1.3.3 YCR102C基因21
• 1.3.4 乙酸毒性及酿酒酵母反应机制21-22
• 1.3.5 目前常见的提高酿酒酵母环境胁迫耐受性的方法22-23
• 1.4 锌状态与酿酒酵母环境胁迫耐受性23-24
• 1.5 本研究工作的目的意义和内容24-26
• 2 SOD1与胁迫耐受性相关研究26-53
• 2.1 引言26
• 2.2 实验材料与仪器26-29
• 2.2.1 菌种及引物26-27
• 2.2.2 培养基及灭菌27
• 2.2.3 主要仪器设备及相关试剂27-29
• 2.3 实验方法29-43
• 2.3.1 自絮凝酵母SPSC01发酵实验29-32
• 2.3.2 抗氧化酶活检测32-35
• 2.3.3 金属离子测定35
• 2.3.4 RT-qPCR分析实验35-37
• 2.3.5 构建过表达菌体37-41
• 2.3.6 酿酒酵母过表达基因SOD1的验证41-42
• 2.3.7 耐性评价实验42-43
• 2.3.8 乙酸发酵实验43
• 2.4 实验结果与讨论43-52
• 2.4.1 锌添加对连续乙醇发酵的影响43-44
• 2.4.2 锌添加对SPSC01连续发酵时胞内酶活的影响44-45
• 2.4.3 锌添加对SPSC01连续发酵时细胞胁迫耐受性的影响45-46
• 2.4.4 锌添加对乙酸胁迫条件下乙醇发酵的影响46
• 2.4.5 锌添加对乙酸胁迫下SPSC01谷胱甘肽的影响46-47
• 2.4.6 锌添加对乙酸胁迫相关基因转录水平的影响47-48
• 2.4.7 SOD1过表达菌株构建48-49
• 2.4.8 过表达SOD1对菌株胁迫耐受性的影响49-50
• 2.4.9 过表达SOD1对菌株乙酸发酵的影响50-52
• 2.5 本章小结52-53
• 3 GRX5与胁迫耐受性相关研究53-73
• 3.1 引言53
• 3.2 实验材料53-55
• 3.2.1 菌种及引物53-54
• 3.2.2 培养基及灭菌条件54
• 3.2.3 主要仪器及试剂54-55
• 3.3 实验方法55-58
• 3.3.1 构建过表达菌株55
• 3.3.2 胁迫耐受性分析55-56
• 3.3.3 胁迫条件发酵性能研究56-57
• 3.3.4 抗氧化酶检测57
• 3.3.5 胞内金属离子检测57-58
• 3.4 实验结果与讨论58-72
• 3.4.1 DNA及转录水平验证过表达菌株58
• 3.4.2 GRX5-Sc4126遗传稳定性实验58
• 3.4.3 GRX5过表达对胁迫耐受性的影响58-61
• 3.4.4 过表达GRX5对乙酸胁迫下发酵性能的影响61-67
• 3.4.5 过表达GRX5对高温胁迫下发酵性能的影响67-68
• 3.4.6 过表达GRX5对双重胁迫下发酵性能的影响68-69
• 3.4.7 过表达GRX5对模拟水解液发酵性能的影响69-71
• 3.4.8 过表达GRX5对水解液稀释液发酵性能的影响71-72
• 3.5 本章小结72-73
• 4 YCR102C与胁迫耐受性相关研究73-93
• 4.1 引言73
• 4.2 实验材料73-75
• 4.2.1 菌种及引物73-74
• 4.2.2 培养基及灭菌条件74-75
• 4.2.3 主要仪器及试剂75
• 4.3 实验方法75-77
• 4.3.1 构建过表达菌株75
• 4.3.2 胁迫耐受性分析75-76
• 4.3.3 胁迫条件发酵性能研究76-77
• 4.3.4 抗氧化酶检测77
• 4.3.5 胞内金属含量检测77
• 4.4 实验结果与讨论77-91
• 4.4.1 DNA及转录水平验证过表达菌株77-78
• 4.4.2 YCR102C-Sc4126遗传稳定性实验78
• 4.4.3 YCR102C过表达对胁迫耐受性的影响78-80
• 4.4.4 过表达YCR102C对乙酸胁迫下发酵性能的影响80-86
• 4.4.5 过表达YCR102C对高温胁迫下发酵性能的影响86-87
• 4.4.6 过表达YCR102C对双重胁迫下发酵性能的影响87-89
• 4.4.7 过表达YCR102C对模拟水解液发酵性能的影响89-91
• 4.4.8 过表达YCR102C对水解液稀释液发酵性能的影响91
• 4.5 本章小结91-93
• 结论93-94
• 创新点94-95
• 展望95-96
• 参考文献96-107
• 附录A 基因序列107-109
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况109-110
• 致谢110-112

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