渗透压对C.glycerinogenes关键代谢基因的调控研究

发布时间：2017-06-29 12:10

  本文关键词：渗透压对C.glycerinogenes关键代谢基因的调控研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是从自然界分离出来的一株耐高渗工业菌株,具有优良的环境胁迫耐受性。磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PYK)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)分别是EMP途径、HMP途径中的关键酶,胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)是甘油合成的关键酶,对耐高渗产甘油假丝酵母高效合成甘油、抵抗渗透压胁迫非常重要,其受渗透压耐代谢调控机理研究进展较少。本研究通过对C.glycerinogenes以上关键代谢酶及其基因在渗透压条件下的发酵水平、蛋白和分子水平及转录水平的研究,初步揭示了渗透压对Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk关键代谢基因的调控机制,为菌株改造和工业化应用提供依据。通过分子克隆技术获得C.glycerinogenes关键代谢酶磷酸果糖激酶(两个亚基)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸激酶的Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk推测编码基因;在已有验证缺失株S.cerevisiae pfk2?和S.cerevisiae zwf?基础上,利用PCR-mediated Technology基因敲除技术获得S.cerevisiae pfk1?与S.cerevisiae pyk1?两株缺失株;将Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk基因在相应缺陷株中互补表达。酶活测定、功能互补结果表明Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk确为编码磷酸果糖激酶(两个亚基)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶,丙酮酸激酶的基因,为后续分子转录水平研究提供了可靠的基础。为考察渗透压对C.glycerinogenes的代谢调控,首先从发酵水平进行分析,研究发现,低渗(20 g·L-1 NaCl)胁迫下不影响菌体生长,其生长及甘油合成与无盐时相似,但生长迟滞4 h,甘油积累量为无盐对照的1.7倍;而高渗(50 g·L-1 NaCl)胁迫使菌体生长延迟12 h,生物量与对照相当,而甘油积累为对照的3倍;代谢流分析发现,在甘油快速合成时期,高渗及低渗胁迫下碳流量均由HMP途径向EMP途径偏转,流向副产物乳酸,乙醇,丙酮酸合成及TCA循环流量减少,而高渗胁迫下的偏转程度更大。PFK、PYK、G6PDH、ctGPD关键酶活水平分析发现,与无盐对照,不同渗透压下,PFK与ctGPD酶活均高于无盐对照(分别最高达1.6倍和3倍)、G6PDH略低于对照(大约80%),PYK明显低于对照,说明渗透压迫使EMP途径总体碳流加强,而进入TCA循环的碳流量减少,ctGPD酶水平大大增加,使碳流主要合成甘油抵御胞外渗透压;G6PDH略低于对照说明受渗透压胁迫使细胞合成减缓(生长期延缓4-12 h);且随渗透压增加,这样的酶水平调控愈强烈。在关键代谢酶基因转录水平研究结果表明:不同渗透压下,Cggpd转录水平上调十分明显,最大上调7.7倍,而基因Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk转录水平差异性并不十分明显,据此推测C.glycerinogenes在应对外界渗透压很可能同时受到酶活性调节和基因表达调节两种调控方式,PFK、PYK、G6PDH等酶的活性受到某些调节因子的调节,而这些调节因子受到渗透压调控,这需要进一步研究。
【关键词】：产甘油假丝酵母 渗透压 代谢 基因 调控
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q933
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 绪论7-12
• 1.1 渗透压与微生物的关系7-8
• 1.1.1 渗透压与相容性物质7
• 1.1.2 渗透压对微生物生长的影响7
• 1.1.3 渗透压影响碳硫在代谢途径中的分布7-8
• 1.2 酵母糖代谢的关键酶8-10
• 1.2.1 磷酸果糖激酶8-9
• 1.2.2 6-磷酸葡萄糖脱氢酶9
• 1.2.3 丙酮酸激酶9
• 1.2.4 甘油-3 磷酸脱氢酶9-10
• 1.3 渗透压对微生物的主要调控方式10
• 1.3.1 HOG途径10
• 1.3.2 代谢应答10
• 1.4 研究意义及主要研究内容10-12
• 1.4.1 研究意义10-11
• 1.4.2 主要研究内容11-12
• 第二章 材料与方法12-19
• 2.1 材料12-14
• 2.1.1 实验菌株与载体12-13
• 2.1.2 工具酶13
• 2.1.3 主要试剂13
• 2.1.4 培养基及用途13-14
• 2.1.5 主要仪器14
• 2.2 方法14-19
• 2.2.1 酵母基因组DNA的提取14-15
• 2.2.2 菌株平板生长实验15
• 2.2.3 目标基因的PCR扩增15-16
• 2.2.4 酵母总RNA提取16-17
• 2.2.5 逆转录17
• 2.2.6 荧光定量PCR17
• 2.2.7 产物测定17
• 2.2.8 酶活力的测定17-19
• 第三章 结果与讨论19-38
• 3.1 关键代谢基因克隆及功能鉴定19-26
• 3.1.1 关键代谢基因的克隆19-20
• 3.1.2 重组质粒的构建20-21
• 3.1.3 S. cerevisiae W303-1A pfk1、pyk1基因缺失株的构建21-23
• 3.1.4 关键代谢基因的生理功能验证23-26
• 3.2 不同渗透压下C. glycerinogenes代谢及发酵水平分析26-33
• 3.2.1 不同渗透压对C. glycerinogenes生长和甘油积累的影响26-28
• 3.2.2 渗透压对C. glycerinogenes发酵的影响28-30
• 3.2.3 渗透压对C. glycerinogenes代谢流的影响30-33
• 3.3 不同渗透压浓度下C. glycerinogenes关键酶水平及其转录水平分析33-38
• 3.3.1 不同渗透压浓度下PFK、G6PDH、PYK、ctGPD关键酶水平变化33-35
• 3.3.2 不同渗透压浓度下关键酶基因Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf、Cgpyk和Cggpd转录水平变化35-38
• 主要结论与展望38-39
• 主要结论38
• 展望38-39
• 致谢39-40
• 参考文献40-43
• 附录43-44
• 附录A：作者在攻读硕士学位期间发表的论文43-44
• 附录B：C. glycerinogenes 代谢网络所涉及的反应式44

  本文关键词：渗透压对C.glycerinogenes关键代谢基因的调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：497843