苦豆子抗盐相关基因的筛选及功能分析

发布时间：2017-06-30 04:01

  本文关键词：苦豆子抗盐相关基因的筛选及功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题,全球约有20%的耕地受到盐害威胁,43%的耕地为干旱、半干旱地区。盐害严重影响植物的生长发育,造成作物减产,并使生态环境日益恶化。在自然条件下,由于环境胁迫而严重影响了作物生长发育,其遗传潜力难以发挥,盐渍不仅影响了作物的产量,而且限制了植物的广泛分布,因此,提高作物的耐盐能力已成为抗逆育种急需解决的关键问题之一。随着分子生物学的发展和转基因技术的成熟,利用转基因技术提高植物的耐盐碱性,已在盐碱土壤改良方面得到广泛的应用。同时,以旱生、耐盐碱植物为研究材料,从中分离克隆得到耐盐碱性显著的基因,是获得抗性基因资源的有效方法。苦豆子(Sophora alopecuroides)为豆科槐属植物,别名、苦豆草、欧苦参等,为多年生草本、根茎地下芽旱生耐盐植物。其耐旱、耐盐性显著,是一个抗性基因丰富的基因资源库。本研究利用苦豆子c DNA酵母表达文库对苦豆子抗盐相关基因进行筛选,并筛选到了2个抗盐相关基因,苦豆子肌醇甲基转移酶基因(Sa IMT)和苦豆子水通道蛋白基因(Sa AQP),同时对其结构初步分析,并利用豆科模式转化系统进一步验证了该基因的抗盐性。为后续抗逆育种奠定理论依据与物质和技术基础。主要研究结果如下1以苦豆子在Na Cl盐胁迫下的根为实验材料,利用SMART法构建全长c DNA文库,构建完成的c DNA酵母表达文库得到的总克隆数为2.3×107Cfu,文库滴度为7.7×106Cfu/ml,插入片段长度约在1.2kb-2.0kb之间,相关参数均符合表达文库质量标准。2利用酵母植物抗逆筛选体系对苦豆子苗期根的c DNA酵母表达文库进行筛选,共筛选到16个抗盐克隆,对这16个基因进行测序及序列比对后,最终得到了2个抗盐相关基因,分别是苦豆子肌醇甲基转移酶基因(Sa IMT)和苦豆子水通道蛋白基因(Sa AQP)。Sa IMT开放阅读框为1095bp,编码364个氨基酸;Sa AQP开放阅读框为753bp,编码250个氨基酸。3对筛选得到的Sa IMT和Sa AQP进行生物信息学分析,发现Sa IMT与其他物种的IMTs蛋白、Sa AQP与其他物种的AQPs蛋白均有较高的同源性和较近的亲缘关系,同时Sa IMT与大豆Gm IMT、Sa AQP和拟南芥At AQP在蛋白序列结构域上均很保守,而二者的蛋白质三级结构都非常相似,预示Sa IMT、Sa AQP与其同源基因有着相似的功能。4对Sa IMT和Sa AQP在苦豆子不同组织中的表达情况进行分析,发现Sa IMT和Sa AQP在根中的表达量都显著高于叶片和茎;对苦豆子幼苗进行Na Cl盐胁迫处理后,Sa IMT和Sa AQP基因的在胁迫初期表达都有明显的升高。5将Sa IMT和Sa AQP利用豆科模式转化系统转化发根农杆菌K599,侵染大豆诱导发状根,对转基因大豆发状根和转基因大豆发状根植物复合体进行Na Cl盐胁迫处理,鉴定Sa IMT和Sa AQP的抗盐性。结果表明,转Sa IMT和Sa AQP的大豆发状根和大豆发状根植物复合体的耐盐性均明显提高,说明Sa IMT和Sa AQP能提高转基因大豆的耐盐性。
【关键词】：苦豆子 cDNA文库 发根农杆菌 抗盐性 功能分析
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文做略语表13-14
• 第1章 绪论14-25
• 1.1 盐害及植物耐盐生理14-15
• 1.1.1 盐对植物的危害14
• 1.1.2 植物耐盐生理14-15
• 1.2 耐盐基因的研究进展15-18
• 1.2.1 植物根部在盐胁迫下的基因调控15
• 1.2.2 Na+和K+的转运网络15-16
• 1.2.3 Na+/H+转运蛋白NHX和SOS16-17
• 1.2.4 高亲和K +转运载体17
• 1.2.5 渗透调节物质17-18
• 1.3 肌醇甲基转移酶的研究进展18-19
• 1.3.1 松醇的生理作用18-19
• 1.3.2 松醇的合成途径19
• 1.4 水通道蛋白的研究进展19-21
• 1.4.1 水通道蛋白的分类19-20
• 1.4.2 水通道蛋白的生物学功能20
• 1.4.3 AQPs参与植物盐胁迫应答的途径20-21
• 1.5 苦豆子研究进展21-22
• 1.6 分子生物学研究方法22-23
• 1.6.1 cDNA文库22-23
• 1.6.2 豆科模式转化系统23
• 1.7 本研究的目的和意义23-25
• 第2章 苦豆子苗期酵母表达文库的构建及抗盐基因的筛选25-41
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 植物材料25
• 2.1.2 菌株25
• 2.1.3 酶及试剂25
• 2.1.4 引物25
• 2.1.5 主要仪器设备25-26
• 2.1.6 试剂配制26
• 2.2 方法26-33
• 2.2.1 植物材料的处理26-27
• 2.2.2 苦豆子叶片丙二醛（MDA）含量测定27
• 2.2.3 苦豆子叶片相对含水量（RWC）测定27-28
• 2.2.4 苦豆子总RNA的提取28
• 2.2.5 苦豆子苗期E.colicDNA文库的质量检测28-29
• 2.2.6 苦豆子苗期cDNA文库质粒提取29-30
• 2.2.7 酿酒酵母INVSC1感受态的制备30
• 2.2.8 文库质粒大规模转化酿酒酵母INVSC1感受态细胞30-31
• 2.2.9 苦豆子苗期酵母表达cDNA文库的构建31
• 2.2.10 酵母植物抗逆基因筛选体系筛选苦豆子抗盐相关基因31-33
• 2.2.11 候选基因的生物信息学分析33
• 2.3 结果与分析33-39
• 2.3.1 苦豆子叶片丙二醛（MDA）含量测定33-34
• 2.3.2 苦豆子叶片相对含水量（RWC）测定34-35
• 2.3.3 苦豆子苗期E.colicDNA文库重组率及插入片段长度鉴定35-36
• 2.3.4 苦豆子苗期酵母表达cDNA文库重组率及插入片段长度鉴定36-37
• 2.3.5 筛选到苦豆子抗盐相关基因的生物信息学分析37-39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 小结40-41
• 第3章 SaIMT和SaAQP基因的生物信息学分析及表达模式分析41-57
• 3.1 材料41
• 3.1.1 植物材料41
• 3.1.2 酶及试剂41
• 3.1.3 引物41
• 3.1.4 主要仪器设备41
• 3.2 方法41-44
• 3.2.1 材料处理及取样41-42
• 3.2.2 植物总RNA的提取42
• 3.2.3 cDNA的合成42-43
• 3.2.4 生物信息学分析43
• 3.2.5 实时荧光定量PCR43-44
• 3.3 结果44-55
• 3.3.1 SaIMT基因的生物信息学分析44-48
• 3.3.2 SaAQP基因的生物信息学分析48-52
• 3.3.3 SaIMT和SaAQP基因在苦豆子不同组织中的表达52-53
• 3.3.4 NaCl胁迫处理下苦豆子中SaIMT和SaAQP基因的表达53-55
• 3.4 讨论55-56
• 3.5 小结56-57
• 第4章 SaIMT基因和SaAQP基因在大豆发状根中的抗盐性分析57-75
• 4.1 材料57-59
• 4.1.1 植物材料57
• 4.1.2 菌株及质粒57
• 4.1.3 酶及试剂57-58
• 4.1.4 引物58
• 4.1.5 主要仪器设备58
• 4.1.6 试剂及培养基配制58-59
• 4.2 方法59-66
• 4.2.1 植物表达载体pCHF1301SaIMT和pCHF1301SaAQp的构建59-62
• 4.2.2 K599发根农杆菌感受态细胞的制备62
• 4.2.3 电击法转化K599感受态细胞62-63
• 4.2.4 发根农杆菌的遗传转化63-64
• 4.2.5 转基因大豆发状根的筛选及鉴定64-65
• 4.2.6 转基因大豆发状根的耐盐性分析65-66
• 4.3 结果66-73
• 4.3.1 植物表达载体pCHF1301SaIMT和pCHF1301SaAQp的构建与鉴定66
• 4.3.2 转基因的大豆发状根的筛选及鉴定66-67
• 4.3.3 转SaIMT和SaAQP基因大豆发状根的耐盐性分析67-73
• 4.4 讨论73-74
• 4.5 小结74-75
• 结论75-77
• 参考文献77-90
• 作者简介及科研成果90-91
• 致谢91

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 周雁鹏;赵宏伟;位昕禹;;转基因大豆的主要特性及安全性评价[J];黑龙江科技信息;2010年31期

2 翟永冠;;转基因大豆掀波澜 公共决策不应让民意缺席[J];科技致富向导;2013年19期

3 钱迎倩;许永松;;“转基因热”背后的冷思考[J];生命世界;2006年02期

4 ;欧洲专利局撤销孟山都公司转基因大豆专利[J];中国食品学报;2007年03期

5 王大元;;转基因大豆产业化15年看转基因大豆食品安全性[J];生命世界;2011年07期

6 朱德斌;邢晓波;;实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆[J];激光生物学报;2012年03期

7 王枫;;转基因大豆食用油安不安全?[J];家庭医学.新健康;2006年12期

8 王轩;;小心你被“锁定”了[J];大科技(百科探索);2007年06期

9 本刊综合;;获批的转基因大豆安全吗?[J];科技致富向导;2013年19期

10 张秀春;林俊扬;彭明;郭丽琼;林俊芳;;表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定[J];热带亚热带植物学报;2006年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 黎明;欧秀元;魏东盛;张代文;邢来君;李明春;;无选择标记转基因大豆表达载体的构建[A];全国植物分子育种研讨会摘要集[C];2009年

2 周霞;张文庆;;广东省转基因大豆和豆制品的监测[A];植物保护与现代农业——中国植物保护学会2007年学术年会论文集[C];2007年

3 周霞;徐正浩;;中国转基因大豆大量涌入造成的危机与对策[A];第二届全国生物入侵学术研讨会论文摘要集[C];2008年

4 欧仕益;曹柏营;米培芝;黄才欢;汪勇;;抗草甘膦转基因大豆中酚类物质研究[A];提高全民科学素质、建设创新型国家——2006中国科协年会论文集[C];2006年

5 吴奇;彭焕;彭可维;陈强强;彭于发;彭德良;;抗草甘膦转基因大豆对豆田主要害虫发生动态的影响[A];科技创新与绿色植保——中国植物保护学会2006学术年会论文集[C];2006年

6 黄文坤;赵俊义;刘崇俊;彭德良;;抗除草剂转基因大豆的基因漂移评价[A];中国植物病理学会2012年学术年会论文集[C];2012年

7 毛德倩;杨晓光;牟维鹏;;利用PCR方法检测转基因大豆和玉米中的GMO[A];营养健康新观察（第十一期）：转基因食品及相关问题专题[C];2001年

8 周波;关荣霞;陶波;刘章雄;常汝镇;邱丽娟;;抗草甘膦转基因大豆基因逃逸检测及分子验证[A];全国作物生物技术与诱变技术学术研讨会论文摘要集[C];2005年

9 黄俊明;李文立;胡帅尔;杨杏芬;陈海珍;谭剑斌;;TaqMan探针检测转基因大豆含量方法的建立及应用[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年

10 陈晓军;叶春江;王超;吕慧颖;李葳;张利明;朱保葛;;GmHsfA1基因克隆及其过量表达提高转基因大豆的耐热性[A];提高全民科学素质、建设创新型国家——2006中国科协年会论文集[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 刘秀荣;欧盟批准一种转基因大豆进入市场[N];经济参考报;2008年

2 钟实;答案出乎意料，转基因大豆并不增产[N];粮油市场报;2009年

3 本报记者 姜洪良;转基因与非转基因大豆展开新一轮博弈[N];中国食品质量报;2009年

4 王妍;巴西本年度转基因大豆获准销售[N];国际商报;2003年

5 金民;转基因大豆进口要严检　[N];国际经贸消息报;2002年

6 本报记者 石金功;转基因大豆知多少[N];粮油市场报;2003年

7 ;亡羊补牢还不晚,黑龙江严防转基因大豆混入粮库[N];粮油市场报;2008年

8 记者 胡军华;金龙鱼陷转基因风波 益海嘉里否认非法使用[N];第一财经日报;2011年

9 本报记者 冯华 蒋建科 陈一鸣;转基因大豆安全吗？[N];人民日报;2012年

10 本报记者 马爱平;转基因大豆油真的会致癌吗？[N];科技日报;2013年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 田芳;饲料及原料中转基因大豆检测技术的研究[D];内蒙古农业大学;2011年

2 张秀春;表达γ-亚麻酸的无标记转基因大豆的培育[D];华南热带农业大学;2005年

3 陈曦;转基因大豆专利的分析研究[D];中国农业科学院;2004年

4 刘营;OsDREB3转基因大豆品系特异性检测方法的研究[D];东北农业大学;2012年

5 许小丹;利用寡核苷酸芯片对Roundup Ready转基因大豆检测及鉴定技术的研究[D];中国农业大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 严红实;四种转基因大豆的毒理学评价[D];延边大学;2015年

2 郑祖亮;转基因大豆流式荧光杂交检测体系的研究[D];天津商业大学;2015年

3 谷晓娜;hrpZ_(Psta)基因表达与转基因大豆抗病性关系的研究[D];吉林农业大学;2015年

4 韩庆梅;高蛋氨酸转基因大豆的鉴定和遗传稳定性分析[D];东北农业大学;2015年

5 吴辉珩;转基因大豆食品安全监管研究[D];湖南农业大学;2014年

6 瞿德敬;转基因大豆与非转基因大豆异黄酮差异分析[D];天津科技大学;2013年

7 刘欣;转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测体系的建立[D];南京农业大学;2014年

8 曾莹;转基因大豆、玉米特异品系LAMP检测方法的研究[D];福建农林大学;2013年

9 郭文云;苦豆子抗盐相关基因的筛选及功能分析[D];吉林大学;2016年

10 叶增民;转基因大豆及其制品的安全性研究分析[D];中北大学;2009年

  本文关键词：苦豆子抗盐相关基因的筛选及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：500447