6个家蚕抗病毒基因在家蚕感染BmNPV和BmBDV后转录水平研究

发布时间：2017-07-01 02:00

  本文关键词：6个家蚕抗病毒基因在家蚕感染BmNPV和BmBDV后转录水平研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：家蚕在中国有悠久的养殖历史,它不仅拥有较高的经济价值,还能作为良好的模式生物拥有较高的科研价值。但是在家蚕的养殖过程中,家蚕容易受到多种因素的影响而造成损失。在我国,由家蚕核型多角体病毒(BmNPV)引起的病毒病占整个病毒病的很大部分,会对家蚕造成极大的危害。家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)是二分DNA病毒科中第一个被发现的成员,具有典型性。通过荧光定量PCR方法,研究家蚕抗BmBDV品系798和感性品系306接种Bm BDV、抗BmNPV品系NB和感性品系华八(三五)接种BmNPV后一些免疫相关基因(bmi、argo、dicer、cap1、cap3和car)在家蚕中肠组织中的转录水平变化情况。结果发现,虽然这些基因的转录水平在不同家蚕品系中差异很大,Bm BDV和BmNPV的感染对基因转录水平的影响也有所不同,但存在一个共同的趋势,即病毒感染能够负调控这些基因的转录水平。在相应病毒感染情况下,bmi和dicer在798和306中下调,在NB和华八(三五)中上调;argo和cap3在798和306中上调,在NB中上调,但在华八(三五)中下调;cap1在798和306中上调,在NB和华八(三五)中也上调;car在798中没有明显变化,在306中下调,在NB中上调,在华八(三五)中下调。这些发现为进一步研究这些基因在病毒感染增殖中的作用打下了良好的基础。car基因是一个羧酸酯酶基因。以家蚕cDNA作为模版,利用PCR技术对car基因进行了克隆。将克隆得到的基因片段与克隆质粒相连进行扩增,将扩增后的片段与表达质粒相连并转入BL21中,经IPTG诱导表达目的蛋白,目的蛋白主要以包涵体方式存在,将目的蛋白变性后利用Ni-NTA对其纯化。将经纯化的蛋白分为两部分,一部分用作制备多克隆抗体,将另一部分复性来用作酶活测定。经过4周对小鼠的免疫之后,成功地制备了多克隆抗体血清。经酶活测定,发现在39℃时目的蛋白的酶活最高。利用荧光定量PCR的方法研究了car基因在家蚕不同生长阶段和组织中的转录水平。经实验发现,脂肪体中car基因的转录水平比其他所有组织中最高的都高,而在头中的转录水平是最低的;car基因在蛹期的转录水平比其他生长阶段都高。
【关键词】：家蚕 抗病毒 羧酸酯酶
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S884.5;Q78
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-20
• 1.1. 家蚕及其抗病毒研究的概况11-14
• 1.1.1. 家蚕基因组的研究11
• 1.1.2. 家蚕抗病毒相关基因研究11-14
• 1.2. 家蚕核型多角体病毒（Bm NPV）14-16
• 1.2.1. 杆状病毒分类14
• 1.2.2. 杆状病毒生活史14-15
• 1.2.3. 杆状病毒基因15-16
• 1.3. 家蚕二分浓核病毒（BmBDV）16-18
• 1.3.1. 家蚕二分浓核病毒基因组16
• 1.3.2. 家蚕二分浓核病毒的蛋白质组16-17
• 1.3.3. 家蚕二分浓核病毒的复制与表达17-18
• 1.4. 研究意义18
• 1.5. 主要研究内容和技术路线18-20
• 1.5.1. 主要研究内容18-19
• 1.5.2. 技术路线19-20
• 第二章 6个抗病毒度相关基因在家蚕抗病毒品系和易感病毒品系中的转录水平20-32
• 2.1. 材料与试剂20-21
• 2.1.1. 家蚕品种、桑叶和病毒20
• 2.1.2. 试剂盒20-21
• 2.1.3. 其他试剂21
• 2.1.4. 实验仪器21
• 2.2. 实验方法21-23
• 2.2.1. 家蚕的饲养及病毒接种方法21
• 2.2.2. RNA提取及c DNA合成21-22
• 2.2.3. 荧光定量PCR22-23
• 2.2.4. 数据处理23
• 2.3. 实验结果23-28
• 2.3.1. 接种Bm BDV后家蚕体内6个基因的表达分析23-26
• 2.3.2. 接种Bm NPV后家蚕体内6个基因的表达分析26-28
• 2.4. 本章讨论及小结28-32
• 第三章 car基因的原核表达、纯化、多克隆抗体制备与酶活测定32-48
• 3.1 材料与试剂32-35
• 3.1.1 菌种、质粒和实验小鼠32
• 3.1.2 工具酶和试剂盒32
• 3.1.3 其他试剂32-33
• 3.1.4 缓冲液33-34
• 3.1.5 培养基34
• 3.1.6 主要仪器34-35
• 3.2 实验方法35-42
• 3.2.1 基因克隆35-36
• 3.2.2 构建克隆载体和表达载体36-38
• 3.2.3. 基因的原核表达38-40
• 3.2.4. 蛋白质的纯化40-41
• 3.2.5. 酶活力测定41
• 3.2.6. 多克隆抗体制备及纯化41-42
• 3.3. 实验结果42-47
• 3.3.1. 基因克隆、克隆质粒构建和表达质粒构建42-43
• 3.3.2. 目的基因的原核表达43-44
• 3.3.3. 蛋白纯化44-45
• 3.3.4. 酶活性测定45-46
• 3.3.5. 抗体验证46-47
• 3.4. 本章讨论与小结47-48
• 第四章 car基因时相转录水平表达分析48-53
• 4.1 材料与试剂48-49
• 4.1.1 实验家蚕48
• 4.1.2 试剂盒48
• 4.1.3 其他试剂48
• 4.1.4 实验仪器48-49
• 4.2 实验方法49-50
• 4.2.1 家蚕饲养及解剖49
• 4.2.2 RNA提取及c DNA合成49
• 4.2.3 荧光定量PCR49-50
• 4.2.4 数据分析50
• 4.3. 实验结果50-51
• 4.3.1. 羧酸酯酶基因在不同组织的表达分析50-51
• 4.3.2. 羧酸酯酶基因在不同发育阶段的表达分析51
• 4.4. 本章讨论及小结51-53
• 第五章 总结与展望53-55
• 5.1 总结53-54
• 5.2 展望54-55
• 参考文献55-61
• 致谢61-62
• 在学期间发表的学术论文62-63
• 参与的主要课题63

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