家蚕小肽tal-like基因的功能研究

发布时间：2017-07-16 08:09

  本文关键词：家蚕小肽tal-like基因的功能研究

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【摘要】：研究发现真核生物基因组中有大量的DNA生成了非典型性的转录本,它们的的功能引起了广泛的争议。这些转录本中包含很多小的开放读码框(small open reading frames,sORFs),这些sORFs起初被认为是不能翻译成蛋白的RNAs,然而,越来越多的证据表明其中的一些sORFs可以翻译成为小肽,而且它们的作用被严重低估了。sORFs翻译成的小肽可能代表一类被忽视的生物活性分子,近年来的研究表明这些小肽在发育、分化等生物过程中具有重要的功能。其中对tal-like基因相关小肽的研究较为深入,该基因最早在果蝇中被发现。在果蝇中,Tal控制基因的表达和组织的形成,作为一个结构和形态发生的链接,对果蝇的生长发育起到非常重要的作用。家蚕作为一种典型的模式经济昆虫,在生长发育的诸多方面与果蝇有很多相似的地方。本研究在成功克隆了家蚕tal-like基因(Bombyx mori tal-like gene,Bmtal)的基础上,检测了Bmtal基因在家蚕五龄三天不同组织的表达水平,研究了过表达Bmtal和抑制Bmtal对家蚕ovo基因(Bmovo)及部分信号通路基因表达的影响,利用RNA-Seq技术开展了过表达Bmtal的Bm N细胞与对照组BmN细胞的比较转录组学研究,为理解Bmtal基因对家蚕生长发育的影响提供了新的线索。主要结果如下:1家蚕tal-like基因的表达谱分析为了研究家蚕tal-like基因的功能,根据序列设计引物进行RT-PCR,成功克隆到1661 bp的Bmtal全长cDNA序列。结构分析显示,Bmtal基因中存在多个sORFs,其中前四个sORFs(A1-A4)分别编码11-12个氨基酸、且序列相似的小肽,紧跟着一个编码32个氨基酸的sORFs(B)。其结构模式与果蝇的非常相似,提示Bmtal基因的功能有可能与果蝇的相似。通过荧光定量PCR(Real-time PCR)分析了Bmtal基因在家蚕五龄三天各种组织的表达水平,结果显示,Bmtal基因在五龄三天的气管丛、马氏管、丝腺中表达量较高,在性腺中也有表达。2 BmTal的亚细胞定位在果蝇中,越来越多的证据表明tal-like基因对个体的生长发育起到至关重要的作用,为了探讨Bmtal的表达规律以及细胞定位特征,将Bmtal的功能区域编码序列与DsRed基因融合,克隆进pET-32a(+),在E.coil中成功表达了重组蛋白。并利用免疫小鼠制备了多克隆抗体。细胞定位结果显示,BmTal定位在BmN细胞的细胞核中。3过表达和抑制Bmtal基因对Bmovo基因及其他信号通路基因的影响为了进一步探讨Bmtal基因的功能,本研究通过过表达和RNAi的方法调查了上调和下调Bmtal基因对Bmovo基因及其他信号通路基因表达水平的影响。结果显示,过表达的Bmtal基因可以调控ovo基因的表达水平,对其他信号通路的部分基因的表达水平也起到明显的影响。4 BmTal相互作用蛋白的筛选与鉴定为了研究Tal-小肽在家蚕BmN细胞中的相互作用蛋白,采用免疫共沉淀技术从过表达BmTal的家蚕BmN细胞中筛选互作蛋白,然后对与BmTal互作的候选蛋白进行质谱鉴定,共鉴定到6种候选蛋白(14-3-3蛋白zeta、纤毛和鞭毛关联蛋白、鞭毛轴丝关联蛋白mst101、多聚泛素、U3小核仁RNA互作蛋白、细胞生长调节核仁蛋白)。信息分析结果显示,这些蛋白涉及到信号传导、细胞增殖分化、蛋白降解、细胞表面突起形成、核苷酸代谢等各个方面。表明BmTal可能通过多种方式调节生物学过程。5过表达Bmtal基因在基因组水平上的转录调节作用将Bmtal基因克隆进昆虫表达载体pIZT-V5/His构建重组质粒pIZT/V5-His-tal,将pIZT/V5-His-tal和pIZT/V5His质粒转染家蚕BmN细胞,通过Zeocin连续筛选两个月后,获得转化2组转化细胞,利用高通量转录组测序技术(RNA-Seq)进行了比较转录组学研究。结果显示,差异表达基因主要集中在与细胞的生长分化及增值过程中。表明Bmtal基因在细胞的生长分化及增值过程中起重要作用。
【关键词】：家蚕 tal-like基因 小肽 过表达
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-25
• 1 小肽概述12-15
• 1.1 小肽的定义12
• 1.2 小肽的生成12-14
• 1.3 小肽的保守性及筛选鉴定方法14-15
• 1.4 小肽生物学功能15
• 2 tal-like基因相关小肽的结构和功能研究15-18
• 3 小肽的研究前景18-19
• 4 研究目的与内容19-20
• 4.1 研究的目的与意义19-20
• 4.2 研究的主要内容20
• 4.3 技术路线20
• 参考文献20-25
• 第二章 家蚕tal-like基因的表达谱分析25-39
• 1 材料与方法25-32
• 1.1 实验材料25-27
• 1.2 常用仪器27
• 1.3 实验方法27-32
• 2 结果与分析32-36
• 2.1 家蚕tal-like基因的克隆32-35
• 2.2 Bmtal的表达谱分析35-36
• 3 讨论36-37
• 参考文献37-39
• 第三章 BmTal的多抗制备及亚细胞定位39-50
• 1 材料与方法39-45
• 1.1 材料与试剂39-40
• 1.2 主要实验试剂的配制40-42
• 1.3 实验方法42-45
• 2 结果与分析45-48
• 2.1 DsRed和tal-A1融合基因表达载体的构建45-46
• 2.2 DsRed-tal-A1的原核表达及抗体的特异性检测46-47
• 2.3 Bmtal的亚细胞定位47-48
• 3 讨论48-49
• 参考文献49-50
• 第四章 过表达Bmtal对Bmovo及部分信号通路相关基因表达的影响50-64
• 1 材料与方法51-53
• 1.1 材料51
• 1.2 实验方法51-53
• 2 结果与分析53-62
• 2.1 pIZT/V5-His重组载体的酶切鉴定53-54
• 2.2 转染细胞的筛选54-55
• 2.3 稳定转化细胞中pIZT/V5-His-tal及相关片段表达的鉴定55-56
• 2.4 过表达的Bmtal及相关功能片段对Bmovo基因的影响56-60
• 2.5 过表达Bmtal对家蚕notch、hairy和delt的影响60-61
• 2.6 过表达Bmtal对家蚕其他信号通路基因的影响61-62
• 3 讨论62-63
• 参考文献63-64
• 第五章 抑制Bmtal基因对Bmovo基因及部分信号通路相关基因表达的影响64-72
• 1 材料与方法64-66
• 1.1 材料64-65
• 1.2 实验方法65-66
• 2 结果与分析66-70
• 2.1 不同siRNA在BmN细胞中对Bmtal基因的抑制效果66-67
• 2.2 抑制Bmtal基因后对Bmovo基因的影响67-68
• 2.3 抑制Bmtal基因后对notch、hairy、delt基因的影响68-69
• 2.4 抑制Bmtal基因后对其他信号通路基因的影响69-70
• 3 讨论70
• 参考文献70-72
• 第六章 BmTal相互作用蛋白的筛选与鉴定72-80
• 1 材料与方法72-75
• 1.1 实验材料72-73
• 1.2 实验方法73-75
• 2.实验结果75-77
• 2.1 Co-IP及质谱分析75-76
• 2.2 BmTal互作宿主蛋白的筛选与鉴定76
• 2.3 候选蛋白的功能分析76-77
• 3 讨论77-78
• 参考文献78-80
• 第七章 过表达Bmtal家蚕BmN细胞转录组的比较分析80-96
• 1 材料与方法81-83
• 1.1 实验材料81
• 1.2 实验试剂81
• 1.3 实验方法81-83
• 2 结果与分析83-88
• 2.1 家蚕细胞中RNA的提取和质量检测83
• 2.2 Reads预处理及参考基因对比83-84
• 2.3 转化pIZT/V5-His和pIZT/V5-His-tal的BmN细胞间表达差异分析84
• 2.4 GO 分类及富集分析84-87
• 2.5 KEGG pathway分析87-88
• 3 讨论88-93
• 参考文献93-96
• 结论96-97
• 1 已取得的成果96
• 2 有待进行的研究96-97
• 附件97-100
• 一、缩略词表97-98
• 二、实验所用载体图谱98-100
• 在校期间发表论文情况100-101
• 致谢101-102

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1 龚永昌;家蚕小肽tal-like基因的功能研究[D];苏州大学;2016年

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本文编号：547720