C3AR1基因促进HL60细胞迁移侵袭及耐药机制研究

发布时间：2017-08-23 02:03

  本文关键词：C3AR1基因促进HL60细胞迁移侵袭及耐药机制研究

  更多相关文章： C3AR1 HL-60 RT-PCR C3AR1 HL-60 迁移 侵袭 C3AR1 HL-60 耐药 依托泊苷 多柔比星 米托蒽醌

【摘要】：第一部分HL60-C3AR1稳转细胞株鉴定目的:验证前期试验中构建的HL60-C3AR1,为研究该基因在HL60细胞株中的生物学功能奠定基础。方法:1.利用流式细胞仪检测HL60-C3AR1、HL60-Venus及亲本株HL60 GFP表达水平;2.提取HL60-C3AR1、HL60-Venus及亲本株HL60总RNA,逆转为c DNA,通过定量PCR方法,利用SYBR Green染料特异扩增C3AR1基因片段,进行定量分析。3.提取HL60-C3AR1、HL60-Venus及亲本株HL60膜蛋白,western方法检测两株细胞C3AR1蛋白表达水平。结果:绿色荧光蛋白GFP在HL60-C3AR1及HL60-Venus表达水平都大于98%;经定量PCR检测,HL60-C3AR1细胞C3AR1基因m RNA表达水平较HL60-Venus及亲本株HL60细胞显著升高;Western结果显示,C3AR1基因蛋白水平在HL60-C3AR1细胞显著高于HL60-Venus及亲本株HL60。结论:C3AR1基因在HL60-C3AR1细胞株稳定高表达,为研究C3a R1基因在HL60细胞中的功能奠定了基础。第二部分高表达C3AR1基因促进HL60细胞发生迁移及侵袭目的:探讨C3AR1对人早幼粒白血病细胞株(Human promyelocytic leukemia cells,HL60)迁移及侵袭的作用和机制。方法:1.在加入或不加C3a和SDF-1条件下,利用transwell小室对HL60-C3AR1及HL60-Venus细胞进行迁移及侵袭实验;2.利用流式细胞术检测CXCR4蛋白的表达水平,确定是否与CXCR4蛋白表达变化有关系;3.利用PCR ARRAY,筛选上调和下调的基因,进一步探讨其可能的发生机制。结果:高表达C3AR1的HL60细胞,在C3a和SDF-1的作用下,细胞迁移及侵袭能力较转染空载体细胞明显增多。PCR ARRAY发现了包括CCL2在内的16个基因显著上调,4个基因显著性下调,但与CXCR4的表达无关。结论:C3a和SDF-1促进高表达C3AR1细胞迁移和侵袭是通过调控CCL2等迁移相关基因实现的。第三部分探讨C3AR1基因促进HL60细胞对拓扑异构酶Ⅱ毒剂依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐药性及其机制目的:探讨C3AR1基因促进HL60细胞对依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐药性及其可能的机制。方法:1.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药以不用浓度分别作用HL60-C3AR1、HL60-Venus细胞24h、48h、72h,CCK8法检测细胞存活率。观察C3AR1对HL60对上述三种化疗药药物敏感性的影响。2.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药以不用浓度分别作用HL60-C3AR1、HL60-Venus细胞24h,Annexin V-PE/7-AAD法检测细胞凋亡水平;3.用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药以适当浓度分别作用HL60-C3AR1、HL60-Venus细胞24h,48h,Hoechst 33342染色检测细胞核形态变化;4.分别用依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌以适当浓度处理细胞24h后,提取总RNA,逆转为c DNA,进行凋亡PCR ARRAY检测,找出上调及下调基因探究其可能发生的机制;5.Western Blot检测共同下调及共同上调的基因,进一步验证其可能的机制;结果:加药实验显示HL60-C3AR1对依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌三种化疗药表现出明显耐药性;凋亡实验显示,加不同浓度依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌分别处理24h,HL60-C3AR1凋亡水平较HL60-Venus显著降低;Hoechst 33342染色显示加适当浓度依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌分别处理24h、48h显示HL60-C3AR1细胞核碎裂情况较HL60-Venus细胞显著降低;凋亡PCR ARRAY筛选出不同上调与下调基因,其中有BIRC7、SOCS2、LCK三个共同下调基因;western检测HL60-C3AR1细胞BIRC7、SOCS2、LCK表达水平较HL60-Venus细胞明显降低。进一步研究发现,C3AR1高表达的HL60-C3AR1细胞株加药处理后,线粒体凋亡途径蛋白发生了改变,抗凋亡蛋白BCL-XL,BCL2表达水平上调,而促凋亡蛋白Bax,Bad表达水平下调结论:C3AR1通过调控BIRC7、LCK、SOCS2等基因进一步通过线粒体途径介导了HL60对TOPOⅡ毒剂VP16、阿霉素、米托蒽醌产生耐药。
【关键词】：C3AR1 HL-60 RT-PCR C3AR1 HL-60 迁移 侵袭 C3AR1 HL-60 耐药 依托泊苷 多柔比星 米托蒽醌
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-12
• 第一部分 HL60-C3AR1稳转细胞株鉴定12-23
• 材料与方法12-18
• 结果18-20
• 讨论20-21
• 参考文献21-23
• 第二部分 C3AR1基因促进HL60细胞发生迁移及侵袭23-33
• 材料与方法23-27
• 结果27-30
• 讨论30-31
• 参考文献31-33
• 第三部分 探讨C3AR1基因促进HL60细胞对依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌耐药性及其机制33-46
• 材料与方法33-36
• 结果36-41
• 讨论41-43
• 参考文献43-46
• 结论46-48
• 综述48-55
• 参考文献51-55
• 英文缩略词表55-56
• 攻读学位期间发表的论文56-57
• 致谢57-58

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 周友珍,李红霞,魏丽惠;拓普替康耐药机制研究进展[J];中国妇产科临床杂志;2005年04期

2 于一云;王红;;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行病学和耐药机制研究新进展[J];感染.炎症.修复;2008年02期

3 吴春燕;赵擎宇;;嗜麦芽窄食单胞菌的耐药机制研究进展[J];国际检验医学杂志;2012年08期

4 张建强;岳鹏;;耐甲氧西林金葡菌耐药机制研究进展[J];人民军医;2013年04期

5 杨新云,方治平,王浴生;β-内酰胺酶抑制剂耐药机制研究初报[J];四川生理科学杂志;2001年02期

6 胡生梅;;产超广谱β-内酰胺酶菌株耐药机制研究进展[J];医学研究杂志;2008年03期

7 胡立芬;叶英;沈为华;李家斌;李旭;;嗜麦芽窄食单胞菌的天然及获得性耐药机制研究进展[J];中国抗生素杂志;2011年09期

8 黎微微;;喹诺酮类抗生素耐药情况及其耐药机制研究[J];中国疗养医学;2013年12期

9 黄英;肺癌耐药机制研究进展[J];中国肺癌杂志;2004年01期

10 李绍红;抗生素耐药机制研究进展[J];中国煤炭工业医学杂志;2005年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周黎明;;喹诺酮类抗菌药耐药机制研究进展[A];第十届全国化疗药理暨抗感染药理高峰论坛资料汇编[C];2010年

2 侯天文;陈晶;李玮;白云;陈兴;;鲍曼不动杆菌临床感染和耐药机制研究进展[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年

3 潘发愤;李梅;;铜绿假单胞菌耐药机制研究进展[A];第二届传染病诊治高峰论坛暨2009年浙江省感染病、肝病学术年会论文汇编[C];2009年

4 张金艳;冯鑫;刘志广;;临床常见念珠菌对氟康唑耐药机制研究[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年

5 周铁丽;林小玲;冯红军;王邦松;;鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药机制研究[A];2006年浙江省感染病、肝病学术会议论文汇编[C];2006年

6 俞云松;;肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药机制研究进展[A];第六届全国抗菌药物临床药理学术会议论文集[C];2006年

7 周铁丽;林小玲;冯红军;李超;刘庆中;王赛芳;;鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药机制研究[A];2006年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2006年

8 俞云松;;革兰阴性菌耐药机制研究进展[A];第8届全国抗菌药物临床药理学术会议暨北京大学临床药理研究所成立三十周年论文集[C];2010年

9 曹戟;刘晓雯;梁立军;杨波;何俏军;;YQ36的抗肿瘤耐药机制研究[A];药学发展前沿论坛及药理学博士论坛论文集[C];2008年

10 汪一萍;应建飞;俞燕红;贺明阳;陈国忠;安敏飞;周成杰;;大肠埃希菌染色体、质粒介导的喹诺酮类药物耐药机制研究[A];2009年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 记者 李大庆;H7N9病毒耐药机制研究获重要进展[N];科技日报;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 颜青;C3AR1基因促进HL60细胞迁移侵袭及耐药机制研究[D];苏州大学;2016年

2 金正江;耐亚胺培南铜绿假单胞菌医院感染现状及耐药机制研究[D];武汉大学;2005年

3 张宁;大肠埃希菌外排泵基因oqxAB的流行及其耐药机制研究[D];扬州大学;2015年

，

本文编号：722323