猪TREM2基因的克隆表达及针对猪TREM2胞外区多克隆抗体的制备

发布时间：2017-09-01 03:04

  本文关键词：猪TREM2基因的克隆表达及针对猪TREM2胞外区多克隆抗体的制备

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【摘要】：髓系细胞触发受体作为先天性免疫受体中的一类,在宿主先天性防御中起着相当重要的作用,到目前为止,对猪髓系细胞触发受体的研究还没有报导,为了深入了解猪髓系细胞触发受体2的生物学功能,首先根据Gen Bank预测的猪TREM2(NM_001256777.1)的全基因序列,从猪肺泡巨噬细胞中提取的RNA为模板扩增TREM2的全基因片段,通过测序验证扩增序列的正确性。选取猪TREM2胞外区基因片段(438 bp)连接到原核表达载体p ET-28a中,利用原核表达系统获得了高效表达于包涵体中的重组TREM2蛋白(约21 k Da)。利用亲和层析技术纯化获得TREM2重组蛋白,以纯化的TREM2重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,每只小鼠免疫约100μg,制备多抗血清,通过Western-Blot证明该多抗血清可以识别猪源TREM2分子。本研究不仅为进一步研究猪TREM2在病原微生物感染中的作用做好铺垫,而且为揭示猪TREM2在猪呼吸性疾病中的作用奠定了基础。本研究分为三个部分:1.猪TREM2基因的克隆与生物信息学分析随着TREM2分子在炎症反应中的作用越来越备受关注,尤其现在猪呼吸道疾病引起的炎症反应在我国兽医临床中的比例越来越大,其传播速度快,发病迅速,给养猪业带来巨大灾难。因此,研究猪TREM2分子在猪呼吸道炎症反应中的作用具有极大的前景。本研究根据Gen Bank预测的TREM2(NM_001256777.1)的全基因序列,利用primer5.0设计扩增引物,然后提取猪肺泡巨噬细胞RNA,反转录c DNA作为模板扩增TREM2全基因片段,通过测序验证扩增序列的正确性。与Gen Bank中的参考序列及其编码的氨基酸进行比对,同时将猪TREM2基因的序列分别于人和小鼠的TREM2序列进行遗传的差异性分析,构建了系统进化树,并分析其氨基酸的亲水性、跨膜区及B细胞抗原表位预测,旨在阐明TREM2蛋白抗原表位的分子生物学特性、系统进化关系、研制多克隆抗体和建立新型检测方法提供理论依据和实验依据。2.猪TREM2胞外区原核表达载体的构建、表达及纯化根据克隆到的猪TREM2分子及序列生物信息学分析结果,选取猪TERM2分子的胞外区进行原核表达,设计原核载体表达引物,将猪TERM2分子的胞外区连接到表达载体p ET-28a中。将重组表达载体转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中,通过对诱导表达条件的优化,确定最佳诱导表达条件。通过SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况,利用His-Trap镍离子螯合层析柱将重组蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化情况。结果显示在0.4 mmol/L浓度的IPTG中表达14h可以使蛋白得到大量表达,并且纯化成功,为多克隆抗体的制备奠定了基础。3.抗猪TREM2多克隆抗体的制备及应用将纯化得到的重组蛋白与弗氏佐剂按1:1的比例混合乳化,免疫小鼠,免疫量约100μg/只,第四次免疫一周后采血,分离血清得到多克隆抗体。通过Western-Blot证明多克隆抗体的特异性,结果显示免疫得到的多克隆抗体不但能与猪源TREM2分子反应,还可以与真核表达载体表达的猪TERM2的全长反应(约31 KDa)。此次制备的抗猪TREM2分子的多克隆抗体为后续研究猪TREM2分子的功能奠定了基础。
【关键词】：髓系细胞触发受体 原核表达 真核表达 Western-Blot 多克隆抗体
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 符号说明5-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1. 引言14-19
• 1.1 猪呼吸道疾病综合征研究进展14-15
• 1.1.1 PRDC发病原因14
• 1.1.2 PRDC发病特点14-15
• 1.1.3 PRDC诱发症状15
• 1.1.4 PRDC防制建议15
• 1.2 TREM研究进展15-19
• 1.2.1 TREM2基因定位及分子结构16-17
• 1.2.2 TREM2的信号通路17
• 1.2.3 TREM2对炎症反应的调控作用17-18
• 1.2.4 TREM2与其他疾病18-19
• 1.3 本研究的内容、目的与意义19
• 2. 材料及方法19-36
• 2.1 猪TERM2基因的基因克隆与序列的生物信息学分析19-21
• 2.1.1 主要仪器19
• 2.1.2 主要试剂19
• 2.1.3 试验中所需的溶液及配置方法19-20
• 2.1.4 猪TREM2扩增引物设计20
• 2.1.5 猪TREM2基因克隆20-21
• 2.1.6 猪TREM2序列及序列的生物信息学分析21
• 2.2 猪TREM2原核表达载体的构建、表达及纯化21-29
• 2.2.1 载体及菌株21
• 2.2.2 主要仪器21-22
• 2.2.3 主要试剂22
• 2.2.4 试验中所需的试剂及配置方法22-23
• 2.2.5 猪TREM2原核表达引物的设计23-24
• 2.2.6 猪TREM2胞外区基因克隆24-25
• 2.2.7 猪TREM2胞外区原核表达载体的构建25-27
• 2.2.8 重组菌株的培养27
• 2.2.9 IPTG诱导重组菌表达27
• 2.2.10 SDS-PAGE27
• 2.2.11 诱导表达条件的优化27
• 2.2.12 表达的重组蛋白的可溶性检测27-28
• 2.2.13 重组蛋白的纯化及鉴定28-29
• 2.3 多克隆抗体的制备及应用29-36
• 2.3.1 试验菌株、载体、动物及细胞29
• 2.3.2 试验中所需的仪器主要仪器29
• 2.3.3 试验所需试剂及溶液的配置方法29-31
• 2.3.4 多克隆抗体的制备31-32
• 2.3.5 真核表达质粒的构建32-34
• 2.3.6 真核重组质粒的大提34
• 2.3.7 CHO细胞的培养34-35
• 2.3.8 CHO细胞的转染35
• 2.3.9 转染样品蛋白的处理35-36
• 2.3.10 Western-Blot36
• 3. 结果与分析36-47
• 3.1 目的基因的克隆及序列的生物信息学分析36-41
• 3.1.1 基因克隆36-37
• 3.1.2 测序结果37-38
• 3.1.3 序列的生物信息学分析38-41
• 3.2 原核表达载体的构建、表达及纯化41-44
• 3.2.1 猪TREM2分子胞外区克隆41
• 3.2.2 原核重组表达质粒的双酶切鉴定41-42
• 3.2.3 初步表达时间优化42
• 3.2.4 IPTG浓度42-43
• 3.2.5 表达蛋白的可溶性检测43
• 3.2.6 蛋白纯化43-44
• 3.2.7 Western-Blot44
• 3.3 多克隆抗体的制备及检测44-47
• 3.3.1 真核重组质粒的双酶切鉴定44-45
• 3.3.2 真核表达质粒的Western-Blot结果45
• 3.3.3 猪肺泡巨噬细胞的Weatern-Blot结果45-47
• 4. 讨论47-49
• 5. 结论49-50
• 参考文献50-54
• 致谢54-55
• 个人简介55-56
• 攻读硕士学位期间发表论文情况56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：769523