TLR2、TLR4基因在小尾寒羊乳房炎乳腺组织中表达的研究

发布时间：2017-09-02 17:24

  本文关键词：TLR2、TLR4基因在小尾寒羊乳房炎乳腺组织中表达的研究

  更多相关文章： 小尾寒羊 乳房炎 Toll样受体2和4基因(TLR2 TLR4) qRT-PCR

【摘要】：Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)是近年来发现的一种非常重要的模式识别受体(PRRs),在先天免疫中感知分子模式(PAMPs),能够识别病原微生物的入侵,激活并参与信号通路过程中的级联反应,诱导产生炎症因子和细胞因子,在宿主抵抗病原感染中发挥着极其重要的作用。为探讨TLR2和TLR4在大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)引起的小尾寒羊(Ovis aries)乳房炎的乳腺组织中的表达情况,本实验以大肠杆菌(O113型)和金黄色葡萄球菌分别人工感染小尾寒羊乳房,建立乳房炎病理模型,采用qRT-PCR检测正常乳腺组织与分别感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后48h、96h乳腺组织中TLR2和TLR4基因的相对表达量,用蛋白免疫印迹(Western-blot,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)SP法研究了正常乳腺组织与分别感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后乳腺组织中TLR2和TLR4蛋白的表达量和组织内分布。结果显示,正常乳腺组织与分别感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后的乳腺组织中均有TLR2和TLR4的表达,而感染细菌后48 h时TLR2和TLR4 mRNA相对表达量最高,96 h时TLR2和TLR4 mRNA相对表达量显著低于48 h(P0.05),正常对照组TLR2和TLR4的相对表达量最低。其中,感染大肠杆菌后乳腺组织中TLR4 mRNA相对表达量极显著高于TLR2(P0.01);感染金黄色葡萄球菌后乳腺组织中TLR2和TLR4 mRNA相对表达量差异不显著。蛋白免疫印迹(WB)检测发现,与对照组相比,感染两种细菌后乳腺组织中TLR4蛋白相对表达量显著增强,且48 h时相对表达量显著高于96 h(P0.05)。通过免疫组织化学染色发现,正常乳腺组织中TLR2和TLR4蛋白主要定位于乳腺腺泡上皮,与对照组相比,感染细菌后乳腺组织中阳性表达明显增强,且感染后48 h时表达最强烈。其中,感染大肠杆菌后乳腺组织中TLR4阳性表达强于TLR2的阳性表达(P0.05);感染金黄色葡萄球菌后乳腺组织中TLR2和TLR4蛋白主要表达在乳腺腺泡腔中脱落的乳腺上皮细胞和以淋巴细胞为主的炎性细胞上,且TLR2与TLR4的阳性表达差异不显著。本研究结果表明,小尾寒羊感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后乳腺组织中TLR2和TLR4的表达明显上调,这为进一步研究TLR2和TLR4在绵羊乳房炎发病过程中的作用机制奠定了基础。
【关键词】：小尾寒羊 乳房炎 Toll样受体2和4基因(TLR2 TLR4) qRT-PCR
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.26
【目录】：

• 摘要2-4
• SUMMRY4-8
• 英文缩略表（Abbreviation）8-9
• 第一章 文献综述9-17
• 1 小尾寒羊乳房炎的研究进展9-11
• 1.1 小尾寒羊种质特性9
• 1.2 乳房炎的研究进展9-11
• 2 Toll样受体研究进展11-15
• 2.1 TLRs的发现及分布11
• 2.2 TLRs信号转导途径11-12
• 2.3 TLRs的功能12-14
• 2.3.1 TLRs对相应配体的识别12-14
• 2.3.2 TLRs在疾病抗感染中的研究14
• 2.4 牛乳房炎与TLR2、TLR4的相关研究进展14-15
• 3 本研究的目的意义15-17
• 第二章 TLR2、TLR4基因在大肠杆菌引起的小尾寒羊乳房炎乳腺组织中的表达17-32
• 1 材料与方法17-24
• 1.1 主要试剂和仪器17-18
• 1.2 实验动物及菌株18
• 1.3 小尾寒羊乳房炎模型的建立18
• 1.3.1 大肠杆菌的培养18
• 1.3.2 大肠杆菌感染小尾寒羊乳房18
• 1.4 引物的设计与合成18-19
• 1.5 总RNA的提取19
• 1.6 RT-PCR扩增19-20
• 1.7 目标基因的克隆和测序20
• 1.8 qRT-PCR检测TLR2、TLR4基因的表达20
• 1.9 Western-blot检测TLR4蛋白在乳腺组中的表达变化20-22
• 1.9.1 乳腺组织总蛋白的提取20-21
• 1.9.2 Western-blot免疫印迹21-22
• 1.10 免疫组织化学染色定位TLR2、TLR4蛋白的分布22-24
• 1.10.1 组织样品的收集22
• 1.10.2 石蜡包埋和切片22-23
• 1.10.3 免疫组化23-24
• 1.11 数据分析24
• 2 结果24-29
• 2.1 总RNA的提取结果24
• 2.2 RT-PCR检测结果24-25
• 2.3 目标基因的克隆和测序25
• 2.4 TLR2、TLR4基因在感染大肠杆菌后的小尾寒羊乳腺组织中的表达25-27
• 2.5 小尾寒羊乳腺组织中TLR4蛋白表达的Western-blot检测27
• 2.6 TLR2和TLR4蛋白在小尾寒羊乳腺组织中的分布检测27-29
• 3 讨论29-32
• 第三章 金黄色葡萄球菌对小尾寒羊乳腺组织TLR2、TLR4基因表达的影响32-42
• 1 材料与方法32-34
• 1.1 主要试剂和仪器32-33
• 1.2 实验动物及菌株33
• 1.3 乳房炎模型的建立33
• 1.3.1 金黄色葡萄球菌的培养33
• 1.3.2 金黄色葡萄球菌感染小尾寒羊乳房33
• 1.4 引物的设计与合成33
• 1.5 RT-PCR扩增33-34
• 1.6 qRT-PCR检测TLR2、TLR4基因表达的变化情况34
• 1.7 Western-blot检测TLR4蛋白在乳腺组中的表达变化34
• 1.8 免疫组织化学染色定位TLR2、TLR4蛋白的分布34
• 2 结果34-39
• 2.1 RT-RCR检测结果34-35
• 2.2 TLR2、TLR4基因在感染金黄色葡萄球菌后的小尾寒羊乳腺组织中的表达35-36
• 2.3 小尾寒羊乳腺组织中TLR4蛋白表达的Western-blot检测36-37
• 2.4 TLR2和TLR4蛋白在小尾寒羊乳腺组织中的表达及分布检测37-39
• 3 讨论39-42
• 第四章 结论42-43
• 参考文献43-49
• 致谢49-50
• 作者简介50-51
• 导师简介51-52

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