番茄根结巨型细胞凋亡相关基因MiPDCD6和LeMYB330的沉默效应研究

发布时间：2017-09-22 05:01

  本文关键词：番茄根结巨型细胞凋亡相关基因MiPDCD6和LeMYB330的沉默效应研究

  更多相关文章： 南方根结线虫 MiPDCD6基因 LeMYB330基因 RNAi VIGS(病毒介导的基因沉默)

【摘要】：根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类重要的植物病原线虫,可以侵染3000多种植物,给农业生产造成巨大的经济损失,据估计,全球每年因根结线虫所造成的损失超过1000亿美元。其2龄幼虫侵人寄主根系,食道腺分泌物经口针注入植物细胞,从而刺激寄主植物根部形成巨型细胞并产生根结。根结线虫食道腺蛋白在线虫与寄主植物互作过程中发挥关键作用。在根结线虫侵染番茄近一个月后,巨型细胞逐渐出现空泡化,内含物大幅度减少,由此推测根结线虫食道腺分泌蛋白是否启动了寄主植物的自主凋亡信号转导途径。本研究以南方根结线虫中编码程序性死亡蛋白6(Programmed cell death protein 6,PDCD6)基因和与之互作的番茄根组织MYB相关蛋白330(Myb-related protein 330-like)基因为研究对象,用RNAi和VIGS技术研究了MiPDCD6基因和LeMYB330基因的功能,为揭示南方根结线虫调控其寄主巨型细胞空泡化的分子机理和抗根结线虫育种奠定了良好的基础。本研究主要取得如下创新性结果:1、揭示了南方根结线虫Mi PDCD6基因的体外沉默效应,利用RNAi技术,将南方根结线虫二龄幼虫浸泡在含有1%间苯二酚,2 mg/mL Mi PDCD6 dsRNA溶液中4h,分别以GFP dsRNA溶液和M9 buffer做为对照。发现用合成的MiPDCD6和GFP的dsRNA对南方根结线虫二龄幼虫进行浸泡处理,在25℃条件下浸泡4h,处理组和对照组的线虫都处于僵直状态,用清水使线虫复苏4h后,对照组线虫恢复正常活动,而处理组线虫出现不规则扭曲运动和抽搐现象。随机统计100条发现,处理组与对照组线虫死亡僵直百分数存在显著性差异。半定量RT-PCR检测结果表明:被dsRNA侵泡后的南方根结线虫MiPDCD6基因的转录水平明显降低。将处理过的2龄幼虫接种到空心菜根部28d后,寄主空心菜的根结数显著降低46.3%。上述研究结果表明MiPDCD6基因在南方根结线虫寄生过程中具有重要的调控作用。2、揭示了南方根结线虫MiPDCD6基因的体内沉默效应,利用VIGS技术,构建pTRV-Mi PDCD6病毒载体,利用农杆菌介导的转化方法,沉默了南方根结线虫MiPDCD6基因,并分析了其对番茄根结数量的影响。接种35d后,pTRV-Mi PDCD6处理的番茄植株中线虫MiPDCD6表达量显著下调,沉默处理的番茄植株根结数比清水处理组减少62.8%,卵囊数减少60%。结果表明,MiPDCD6基因沉默对根结线虫病害具有很好的防控效果,也说明MiPDCD6基因可能参与线虫的寄生过程,并在其中发挥重要的调控作用。3、揭示了番茄LeMYB330基因的沉默效应,利用VIGS技术,构建pTRV-LeMYB330病毒载体,利用农杆菌介导的转化方法,沉默了番茄LeMYB330基因,并分析了其对番茄根结数量的影响。接种35d后,pTRV-LeMYB330处理的番茄植株中LeMYB330基因表达量显著下调,沉默处理的番茄植株根结数比清水处理组增多6.9%,卵囊数增多15.3%,但未达到显著水平。结果表明,LeMYB330基因沉默可能降低了番茄对根结线虫的抗性,更加有利于根结线虫的侵染。
【关键词】：南方根结线虫 MiPDCD6基因 LeMYB330基因 RNAi VIGS(病毒介导的基因沉默)
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.412
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩写词及英汉对照7-12
• 1 前言12-23
• 1.1 根结线虫病的发生与防治概况12-14
• 1.2 RNAi及其在基因功能研究中的应用14-16
• 1.2.1 RNAi的机制15
• 1.2.2 RNAi技术在防治植物寄生线虫上的应用15-16
• 1.3 VIGS技术及其在基因功能研究中的应用16-18
• 1.3.1 VIGS的定义及原理16-17
• 1.3.2 VIGS技术在基因功能研究中的应用17-18
• 1.4 PDCD6基因功能研究进展18-19
• 1.5 MYB基因功能研究进展19-21
• 1.6 研究目的和意义21-23
• 2 材料与方法23-44
• 2.1 材料23-26
• 2.1.1 实验材料23
• 2.1.2 供试植物23
• 2.1.3 菌株及质粒载体23
• 2.1.4 供试试剂及配制23-24
• 2.1.5 培养基24-25
• 2.1.6 电泳25
• 2.1.7 提取RNA的实验用品及试剂25
• 2.1.8 常用仪器设备25-26
• 2.2 方法26-44
• 2.2.1 植物材料培养26
• 2.2.2 线虫接种26
• 2.2.3 侵染前二龄幼虫的收集26
• 2.2.4 MiPDCD6基因的体外RNAi26-31
• 2.2.5 半定量RT-PCR检测干涉效果31-34
• 2.2.6 南方根结线虫MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因的VIGS效应34-44
• 3 结果与分析44-58
• 3.1 MiPDCD6基因的体外RNAi效应44-49
• 3.1.1 MiPDCD6基因和外源基因GFP体外转录模板的制备44
• 3.1.2 MiPDCD6基因和外源基因GFP的dsRNA合成44-45
• 3.1.3 MiPDCD6和GFP体外RNAi对线虫活力的影响45-46
• 3.1.4 MiPDCD6和GFP体外RNAi对南方根结线虫侵染力的影响46-47
• 3.1.5 半定量RT-RCR检测dsRNA浸泡对MiPDCD6表达量的影响47-49
• 3.2 南方根结线虫MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因的VIGS效应49-58
• 3.2.1 目的基因片段的克隆与鉴定49-52
• 3.2.2 VIGS载体的构建与鉴定52-54
• 3.2.3 VIGS结果与检测54-58
• 4 结论与讨论58-64
• 4.1 结论58
• 4.2 讨论58-64
• 4.2.1 南方根结线虫MiPDCD6基因体外RNAi58-60
• 4.2.2 南方根结线虫MiPDCD6基因VIGS效应分析60
• 4.2.3 番茄LeMYB330基因的VIGS效应分析60-61
• 4.2.4 影响VIGS的因素61-64
• 致谢64-65
• 参考文献65-71
• 附录71-72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：898889