刺槐中三个新分离基因在共生固氮过程中的功能研究

发布时间：2017-09-24 19:23

  本文关键词：刺槐中三个新分离基因在共生固氮过程中的功能研究

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【摘要】：本研究以刺槐(Robinia pseudoacacia)---中慢生根瘤菌(Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123)共生固氮体系为模式,以之前实验室采用抑制差减杂交技术建立的刺槐根部c DNA文库中筛选得到的三个宿主植物基因(fan37、fan84、f107)作为研究对象,利用q RT-PCR技术对这三个基因在刺槐根部及结瘤过程中的动态表达特征进行了分析;通过RACE方法获得其中两个基因(fan84、f107)的全长c DNA序列,构建了三个基因的RNAi载体及其中两个基因(fan84、f107)的过量表达与亚细胞定位载体;结合刺槐毛状根转化体系,并借助发根农杆菌介导用构建好的载体转化宿主植物根部并进行以下分析研究:接菌第10天进行荧光显微镜下侵染事件的观察与统计、利用q RT-PCR分析目的基因在接菌15天和接菌30天两个不同时期的RNAi效率和过量表达效率、分别对RNAi转化苗在接菌第30天和过量表达转化苗在接菌第45天的株高、根长、鲜重以及有效结瘤数进行观察和统计、分别取接菌第30天的RNAi根瘤及接菌第45天的过量表达根瘤进行石蜡切片观察。通过以上实验,从表型及分子水平初步揭示这三个基因在刺槐共生根瘤形成过程中的的功能。1、fan84和f107 cDNA全长的获得采用c DNA末端快速扩增法(RACE)技术,以刺槐接种根瘤菌后第15天和第20天根中的总RNA为模板,分别构建5’和3’RACE c DNA文库;根据实验室前期已经获得的基因片段信息分别设计目的基因特异性引物GSP1,GSP2,扩增并获得这两个基因的5’和3’序列,通过重叠区的比对拼接获得基因全长c DNA序列;2、fan84和f107亚细胞定位载体的构建及蛋白的定位分析利用获得的全长c DNA序列的ORF区设计相应的亚细胞定位引物,构建目的基因亚细胞定位载体,通过洋葱表皮细胞瞬时表达以及农杆菌介导转化宿主根部,分别研究了靶蛋白在洋葱表皮细胞和刺槐毛状根细胞中的分布。结果显示,fan84与GFP融合蛋白在细胞膜、细胞核、细胞质中都有分布;f107与GFP融合蛋白则主要在细胞核、细胞膜中表达。3、目的基因干扰载体、过量表达载体的构建及其结瘤表型分析构建基因fan37、fan84、f107 RNA干扰载体和基因fan84、f107过量表达载体,通过发根农杆菌介导转化刺槐根部,观察目的基因沉默或过表达后对刺槐植株发育,根瘤菌侵染过程以及根瘤形成的影响。结果表明,在接种后15d和30d的RNAi根中目的基因的表达被有效沉默,过表达根中目的基因的表达量均显著升高。目的基因被干扰后,接菌后10天进行侵染事件的统计,结果显示,fan84干扰植株根毛卷曲、根毛侵染线、皮层侵染线、根瘤原基数目均明显下降,fan37干扰植株中除了皮层侵染线数目与对照无显著区别外,其余各项指标也都降低;与对照相比,f107干扰后不影响根毛卷曲数目,但是侵染线和根瘤原基形成明显减少。与接菌后30d的对照相比,fan37和fan84 RNAi刺槐苗表现为植株矮小、根毛粗短稀疏,其株高、根长、鲜重、结瘤数目明显减少;f107干扰苗表现为植株矮小,株高、鲜重降低,但根长和结瘤数目没有明显改变。接种后30天根瘤的石蜡切片观察结果表明:fan37、fan84干扰后的植株根瘤中的侵染细胞在数目及密集程度上不及对照根瘤,特别是fan84;f107干扰后的植株根瘤中侵染区明显增大,其中可见较多的侵染线,表明根瘤菌的释放受到抑制。豆血红蛋白基因q PCR分析显示,三个目的基因的沉默使得根瘤的功能受损。过量表达结果在表型上:fan84过表达刺槐表现为根长变长,鲜重增加,株高和结瘤数与对照无差异;f107刺槐表现为鲜重降低,结瘤数目减少,而株高和根长均无显著差异。fan84和f107过量表达植株的根瘤石蜡切片与对照相比,在接菌45d,根瘤内部含菌细胞数量依然很多,细胞形态也没有发生皱缩等衰老迹象。
【关键词】：刺槐 共生相关基因 亚细胞定位 RNA干扰 过量表达
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.27;Q945.13
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.1 固氮作用11
• 1.2 豆科植物和生物固氮11-17
• 1.2.1 豆科植物与根瘤菌11
• 1.2.2 根瘤器官的形成11-13
• 1.2.3 根瘤的类型：定型瘤和不定型瘤13-14
• 1.2.4 豆科植物结瘤分子机制14-17
• 1.3 植物基因功能研究技术17-18
• 1.4 技术路线18-19
• 第二章 目的基因的时空表达分析与cDNA末端的快速扩增(RACE)19-30
• 2.1 引言19
• 2.2 目的基因的时空表达分析19-21
• 2.3 材料、试剂和仪器21-22
• 2.3.1 实验材料及载体21
• 2.3.2 实验试剂21
• 2.3.3 实验仪器21-22
• 2.4 实验方法22-26
• 2.4.1 刺槐根总RNA的提取及基因组DNA的去除22-23
• 2.4.2 候选基因的cDNA末端快速扩增(RACE)23-25
• 2.4.3 目的片段胶回收25
• 2.4.4 目的片段连接T载体并转化入大肠杆菌25
• 2.4.5 菌落PCR检测目的片段的连接情况25-26
• 2.4.6 质粒的提取26
• 2.4.7 全长的获得及序列分析26
• 2.5 结果与分析26-29
• 2.5.1 总RNA提取及基因组DNA的去除结果26-27
• 2.5.2 RACE反应结果27-29
• 2.6 讨论29-30
• 第三章 目的基因的亚细胞定位30-38
• 3.1 引言30
• 3.2 实验材料、仪器30
• 3.2.1 实验材料30
• 3.2.2 实验仪器30
• 3.3 实验方法30-33
• 3.3.1 亚细胞定位载体的构建30-32
• 3.3.2 基因枪转化洋葱表皮细胞32-33
• 3.4 结果与分析33-37
• 3.4.1 亚细胞定位载体的构建33-35
• 3.4.2 亚细胞定位结果与分析35-37
• 3.5 讨论37-38
• 第四章 目的基因的RNA沉默与过表达38-67
• 4.1 引言38
• 4.2 实验材料、试剂和仪器38
• 4.2.1 实验材料38
• 4.2.2 试剂与配方38
• 4.2.3 实验仪器38
• 4.3 实验方法38-45
• 4.3.1RNAi载体的构建38-41
• 4.3.2 过量表达载体的构建41
• 4.3.3 重组质粒电转化发根农杆菌K59941-42
• 4.3.4 刺槐的转化体系42-43
• 4.3.5 实验结果鉴定43-45
• 4.4 结果与分析45-65
• 4.4.1 目的基因的扩增结果45-46
• 4.4.2 RNA沉默载体的构建46-47
• 4.4.3 过量表达载体的构建47-48
• 4.4.4 转化苗植株表型检测48-52
• 4.4.5 刺槐根部提取的总RNA质量检测52-53
• 4.4.6 干扰及过表达效率检测53-56
• 4.4.7 转化苗植株表型及根瘤的形态56-63
• 4.4.8 根瘤显微形态观测63-65
• 4.5 讨论65-67
• 第五章 结论67-68
• 参考文献68-75
• 附录75-79
• 致谢79-80
• 作者简介80

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本文编号：913035