石斑鱼趋化因子和趋化因子受体基因鉴定及功能初步研究

发布时间：2017-10-03 22:17

  本文关键词：石斑鱼趋化因子和趋化因子受体基因鉴定及功能初步研究

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【摘要】：趋化因子和趋化因子受体通过其相互作用介导了机体免疫系统由先天性到获得性免疫的转变,在免疫系统中具有重要的地位。同时,趋化因子受体能激活多种信号通路,对细胞的增殖、存活、凋亡等生理活动发挥重要的调节作用。大量研究证明了刺激隐核虫可引起鱼类的先天性和获得性免疫反应,而本课题组前期研究显示趋化因子系统可能参与宿主抗刺激隐核虫免疫应答,但具体的作用机制尚不清楚。为阐明趋化因子系统在宿主抗刺激隐核虫中的作用,本文基于斜带石斑鱼转录组数据库得到的趋化因子和受体基因的EST(Expressed Sequence Tag)序列,克隆获得了2个趋化因子和8个趋化因子受体基因序列,并通过荧光定量PCR对这些基因在刺激隐核虫感染前后的转录表达情况进行了分析。此外,还构建了趋化因子和多个趋化因子受体的真核表达重组质粒,并制备了趋化因子受体XCR1-3的多抗,最后,通过荧光素酶双报告基因实验研究了趋化因子受体信号通路对NF-κB的调节作用。实验主要结果如下:(1)论文克隆获得了斜带石斑鱼趋化因子CCL25和CXCL12-2,以及趋化因子受体CCR9-1、CCR9-2、CXCR3、CXCR4-2、CXCR7、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3的序列,其ORF区的长度分别为324 bp、309 bp、1119 bp、1125 bp、1110 bp、1152 bp、1137 bp、1011 bp、1044 bp和1074 bp。进化分析表明克隆得到的趋化因子和受体基因编码氨基酸序列均与相对应的鱼类同源序列有较高的同源性;(2)荧光定量PCR结果显示,在健康石斑鱼组织中,CCL25、CXCR4-2、CCR9-1、CCR9-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3等基因主要在免疫组织上表达,其中,CXCR4-2在头肾中表达量最高,CCL25、CCR9-1和CCR9-2在胸腺中表达量最高;而刺激隐核虫感染后的表达谱分析显示CCL25、CXCL12-2、CXCR4-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3的在感染部位——皮肤和鳃的表达量均表现出一定程度的上调,其中CCL25、CXCL12-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3变化显著,CCL25、CXCL12-2、CCR9-1、CXCR3、CXCR4-2、XCR1-1、XCR1-2和XCR1-3在造血组织——头肾和脾脏中均表现为上调,暗示了相关免疫细胞的增殖;(3)论文表达了CCL25、CXCL12-2和XCR1-3融合蛋白,为下一步开展趋化功能研究奠定了基础,此外,利用重组表达的XCR1-3蛋白制备了多克隆抗体,并成功标记了石斑鱼外周血XCR1-3+细胞,为开展XCR1-3+细胞的组织分布及抗病功能研究提供工具;(4)论文构建了CCL25和CXCL12候选受体的重组真核表达质粒pcDNA3.1-HA-CCR9-1、CCR9-2、CXCR4-2和CXCR7,这四个重组质粒在HEK293T和CLC细胞系中均能表达。在HEK293T细胞系中,四个趋化因子受体重组真核表达质粒均表现出抑制NF-κB的活性,但抑制效果不显著。而在CLC细胞系中,CCR9-1、CCR9-2和CXCR4-2对NF-κB的活性仍起着抑制作用,其中,CCR9-2和CXCR4-2抑制效果显著,而CXCR7却能显著激活NF-κB的活性,而相关机制还有待进一步的研究。
【关键词】：石斑鱼 趋化因子 趋化因子受体 刺激隐核虫
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词7-10
• 1 前言10-25
• 1.1 鱼类的免疫系统10-15
• 1.2 趋化因子和趋化因子受体概况15-21
• 1.3 鱼类趋化因子和趋化因子受体研究进展21-22
• 1.4 刺激隐核虫及其免疫学研究进展22-24
• 1.5 研究的目的和意义24-25
• 2 趋化因子和趋化因子受体基因的克隆与序列分析25-42
• 2.1 材料25-26
• 2.2 试验方法26-30
• 2.3 结果与分析30-39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 小结40-42
• 3 趋化因子和趋化因子受体基因的表达谱分析42-51
• 3.1 材料42-43
• 3.2 试验方法43-44
• 3.3 结果与分析44-48
• 3.4 讨论48-49
• 3.5 小结49-51
• 4 趋化因子和趋化因子受体功能初步研究51-71
• 4.1 材料51-54
• 4.2 试验方法54-62
• 4.3 结果与分析62-68
• 4.4 讨论68-70
• 4.5 小结70-71
• 全文总结71-72
• 致谢72-73
• 参考文献73-82

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本文编号：967033