Cas9介导的水牛奶相关基因的多位点基因打靶

发布时间：2017-10-06 08:12

  本文关键词：Cas9介导的水牛奶相关基因的多位点基因打靶

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【摘要】：水牛奶营养价值高,富含钙,能值高,奶品质好。中国水牛的数量资源极其丰富,但水牛奶业的起步较晚,并且奶业的地域发展不平衡,因此,开发水牛奶业具有重大意义。而牛乳中含量丰富的的αs1-酪蛋白在人乳中并不存在,同时也是人摄入牛奶时重要的过敏原。本研究选取与αs1-酪蛋白表达密切相关的CSN1S1基因和与产奶量密切相关的DGAT1基因,通过多位点基因打靶技术结合Cas9体外人工内切酶对在水牛胎儿肾脏成纤维细胞对CSN1S1基因和DGAT1基因进行靶向操作。首先,由公司针对CSN1S1基因的CDS序列设计三个RNAi靶位点,分别构建shRNA瞬时表达质粒pGPU6-shRNA-NEO-1,pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3和阴性对照pGPU6-shRNA-NEO NC。然后通过EGFP真核表达载体pEGFP-N1和pEGFP-C2融合CSN1S1基因,构建质粒pEGFP-N1-CSN1S1和pEGFP-C2-CSN1S1。将shRNA瞬时表达质粒和绿色荧光融合表达质粒共转染293T细胞,电子显微镜下观察绿色荧光的表达情况。结果表明,三组shRNA瞬时表达质粒均可有效抑制绿色荧光的表达,其中pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3的效果要稍好于pGPU6-shRNA-NEO-1。后提取转染后细胞的总RNA,经过逆转录后用CSN1S1基因特异引物做半定量PCR,进行灰度分析,结果也同时证明了三个靶点均有效,但三组shRNA表达质粒对CSN1S1的干扰效果没有显著差异。然后,选择shRNA瞬时表达质粒pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3质粒作为模板,设计引物并扩增U6-shRNA-NEO片段,将其克隆到打靶载体骨架P UC19-HRDS1-HRDS2上面,进而构建针对CSN1S1基因的多位点打靶质粒PUC19-H RDS1-U6-shRNA-NEO-HRDS2-1和PUC19-HRDS1-U6-shRNA-NEO-HRDS2-2。接着,由公司构建DGAT1基因打靶质粒PUC19-HRDS1-SV40-DGAT1-ZEO-pA-HRDS2。将打靶质粒与Cas9表达质粒共转染水牛胎儿牛肾成纤维细胞,设置三个对照组,分别是打靶质粒单独转染组,打靶质粒和Cas9表达质粒共转染组,未经转染空细胞组,72h后分别提取每组细胞的基因组DNA,设计引物检测基因的整合。结果表明,打靶质粒单独转染组,打靶质粒和Cas9表达质粒共转染组均检测到了基因的整合,空细胞组没有基因的整合。之后设计定点整合引物,用提取的细胞基因组做模板,均未检测到基因的定点整合。
【关键词】：RNA干扰 多位点基因打靶 水牛 αs1-酪蛋白
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823.83
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 常用缩略词表6-9
• 1 前言9-14
• 2 材料与方法14-34
• 2.1 实验材料14-16
• 2.1.1 实验细胞、质粒、菌种、基因14
• 2.1.2 主要试剂和耗材14-15
• 2.1.3 主要试剂配方15
• 2.1.4 主要仪器设备15-16
• 2.2 实验方法16-34
• 2.2.1 RNAi瞬时表达载体的构建16
• 2.2.2 绿色荧光融合表达载体的构建16-22
• 2.2.3 293T细胞的培养22-23
• 2.2.4 RNAi干扰效果的检测23-28
• 2.2.5 CSN1S1打靶载体的构建28-30
• 2.2.6 DGAT1打靶载体的构建30
• 2.2.7 牛肾成纤维细胞的培养30-31
• 2.2.8 牛肾细胞的转染以及外源基因的整合检测31-34
• 3 结果与分析34-45
• 3.1 RNAi瞬时表达载体构建结果34-35
• 3.2 融合荧光表达载体的构建结果35-37
• 3.3 干扰效果的验证结果37-41
• 3.3.1 荧光验证37-38
• 3.3.2 m RNA验证38-41
• 3.4 CSN1S1基因打靶载体的构建结果41-42
• 3.5 DGAT1基因打靶载体的构建结果42-43
• 3.6 牛肾胎儿成纤维细胞的转染以及外源基因的整合检测结果43-45
• 3.6.1 牛肾胎儿成纤维细胞的转染43-44
• 3.6.2 外源基因的整合检测结果44-45
• 4 讨论45-48
• 4.1 RNAi序列的设计及筛选45-46
• 4.2 融合表达载体的构建以及融合荧光的表达46
• 4.3 基因打靶载体的构建46-47
• 4.4 基因整合结果的讨论47-48
• 5 结论48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-54
• 附录54-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李剑芳;王春娟;邬敏辰;;连接肽的设计及在融合蛋白中的应用[J];食品与生物技术学报;2015年11期

2 邹宇光;莫玉叶;庞实锋;张强;杨芳;易文君;何国锋;喻巍巍;郑克勤;;Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选[J];贵阳医学院学报;2012年06期

3 唐冬生;蒋泓;刘芳;王克振;张勇;曾芳;梁沂梅;邓廷贤;欧阳宏佳;李月琴;张细权;周天鸿;;锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶[J];科学通报;2012年09期

4 胡军;查永生;李敏;;安庆地区97例慢性荨麻疹患者食物不耐受检测分析[J];中外医学研究;2012年02期

5 夏立群;梁海鹰;张红莲;秦启伟;;RNA干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46与绿色荧光蛋白融合基因的表达[J];水产学报;2010年04期

6 苏艳;张宝江;申煜;黄嘉驷;;信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响[J];微生物学报;2009年03期

7 王雷;丁春华;栾爽艳;;我国水牛奶业的发展现状与开发前景[J];中国奶牛;2008年04期

8 梁明振;杨炳壮;苏安伟;陆月青;赵红梅;李忠权;;水牛奶营养价值评价[J];广西畜牧兽医;2007年03期

9 单志新;林秋雄;符永恒;邓春玉;李晓红;余细勇;;用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告分子筛选有效的siRNA[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年03期

10 罗曾玲;高金燕;陈红兵;;牛乳中主要过敏原的研究进展[J];食品科学;2007年02期

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本文编号：981677