家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究

发布时间:2016-09-04 11:01

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《浙江大学》 2009年

家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究

蓝航莲  

【摘要】:人生长激素(hGH)是由人垂体前叶细胞分泌的一种多肽类激素,对机体的组织、器官以及各种代谢活动都起着重要的生理功能。本试验首先构建了重组质粒pET28a—hGH,经终浓度为1 mM IPTG在大肠杆菌中诱导带rhGH融合蛋白的表达,融合蛋白带有His_6标签;纯化得到无生物活性的融合蛋白作为抗原免疫雄性新西兰大白兔,收集抗血清后采用硫酸铵沉淀方法纯化多克隆抗体;抗血清的效价为1:25600;Western blot结果显示多克隆抗体存在较高的特异性,以rhGH为抗原制得的抗体也可以和hGH蛋白发生特异性结合反应。高效抗—hGH多克隆抗体的制备为下游的工作奠定了基础。 昆虫杆状病毒是与原核、酵母以及哺乳动物细胞系统并存的表达外源蛋白的一类重要表达系统,因其可以高效表达有活性的外源蛋白而被广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统是昆虫杆状病毒的重要组成部分,本试验利用该系统在受体家蚕细胞和蚕蛹中合成hGH。利用共转染技术携带有hGH基因的重组转移质粒pBacPAK—hGH与线性化的BmBacPAK6基因组DNA在家蚕细胞中发生同源重组,产生有插入hGH基因的重组家蚕杆状病毒;利用空斑分析以及lac—Z基因的蓝白筛选纯化重组病毒vBmhGH,并通过Southern杂交验证重组病毒基因组中的hGH基因。TCID50检测重组病毒的滴度为6.0×10~8 PFU/ml;家蚕细胞感染vBmhGH表达rhGH,最大表达量为约52μg/10~6细胞;家蚕蛹感染vBmhGH,在血淋巴中检测到rhGH,并且感染病毒120 h后rhGH的合成达到最大值约300μg/蛹;制取感染vBmhGH的蚕蛹血淋巴,利用凝胶层析、IP以及RPC的方法分离纯化rhGH,结果从1 ml血淋巴中可以分离得到约180μg rhGH;进一步的体外细胞试验表明,蚕蛹表达的rhGH可以促进K562细胞的集落形成;对去垂体大鼠进行灌喂给药,结果rhGH不仅可以促进大鼠体重的增加,也可以促进肝脏以及胫骨的生长,表明蚕蛹表达的hGH具有体内生物活性。同时研制的hGH口服胶囊经动物急性毒性和长期毒性试验等临床前研究表明,hGH口服胶囊无明显的急性毒性,长期服用hGH口服胶囊无明显的毒副作用。因此家蚕蛹表达的rhGH有望在将来成为一种潜在的口服给药治疗呆小症和阿尔茨海默氏病等hGH缺乏相关疾病的潜在蛋白类药物。hGH口服胶囊的动物抗氧化试验和果蝇寿命延长试验表明,其可以显著降低心脏脂褐素含量和提高肝脏SOD比活力,延长果蝇平均寿命。因此我们研制的hGH口服胶囊具有延缓衰老的功效,是一种潜在的口服给药抗衰老蛋白类药物。利用蚕蛹高效表达有生物活性的rhGH为拓展hGH的应用领域,开发基于hGH的药品和保健品打下了良好的基础。

【关键词】:
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q78
【目录】:

  • 缩略词(Abbreviation)8-10
  • 中文摘要10-12
  • Abstracts12-14
  • 第一章 文献综述和试验设计14-47
  • 第一节 人生长激素(hGH)研究进展14-28
  • 1.hGH的结构14-16
  • 2.hGH的生理功能16-19
  • 3.hGH的制备、提纯19-21
  • 4.hGH的测定方法21-22
  • 5.hGH的临床应用22-28
  • 第二节 家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统研究进展28-36
  • 1.杆状病毒表达系统的建立及其原理28-29
  • 2.杆状病毒载体表达系统的改进29-33
  • 3.杆状病毒载体表达系统的特点33-34
  • 4.家蚕/BmNPV系统相对于Sf细胞/AcNPV系统的优势34-36
  • 第三节 试验设计方案36-38
  • 1.试验目的和意义36
  • 2.本研究的主要内容36-37
  • 3.试验流程图37-38
  • 参考文献38-47
  • 第二章 hGH融合蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备47-71
  • 1.材料与方法47-62
  • 1.1 材料、试剂及仪器47-53
  • 1.2 实验方法53-62
  • 2.结果与讨论62-69
  • 2.1 重组质粒pET28a—hGH的构建62-64
  • 2.2 E.coli疗中重组蛋白rhGH的诱导表达64-66
  • 2.3 rhGH重组蛋白的纯化66-67
  • 2.4 兔抗rhGH抗血清的效价测定67-68
  • 2.5 纯化多克隆抗体的特异性鉴定68-69
  • 3.结论69-70
  • 参考文献:70-71
  • 第三章 重组家蚕杆状病毒vBmhGH的构建及纯化71-94
  • 1.材料与方法72-84
  • 1.1 材料72-74
  • 1.2 方法74-84
  • 2.结果与讨论84-91
  • 2.1 重组质粒pBacPAK—hGH的鉴定84-85
  • 2.2 家蚕杆状病毒Bm-BacPAK_6基因组DNA的线性化85-86
  • 2.3 共转染及重组病毒的纯化86-88
  • 2.4 重组病毒的鉴定88-89
  • 2.5 重组病毒滴度的测定89-91
  • 3.结论91-92
  • 参考文献92-94
  • 第四章 rhGH在家蚕细胞以及蚕蛹中的表达94-110
  • 1.材料与方法94-100
  • 1.1 材料94-95
  • 1.2 方法95-100
  • 2.结果与讨论100-108
  • 2.1 hGH标准曲线绘制100
  • 2.2 rhGH在家蚕细胞中的合成100-102
  • 2.3 rhGH基因在蚕蛹中的表达102-105
  • 2.4 rhGH的纯化105-108
  • 3.结论108-109
  • 参考文献109-110
  • 第五章 蚕蛹表达rhGH的生物活性研究110-127
  • 1.材料与方法110-115
  • 1.1 材料110-111
  • 1.2 方法111-115
  • 2.结果与讨论115-123
  • 2.1 rhGH促人红白血病细胞克隆形成115-116
  • 2.2 去垂体大鼠的体重增加试验116-117
  • 2.3 去垂体大鼠的肝重增加以及胫骨试验117-118
  • 2.4 hGH口服胶囊小鼠抗氧化实验结果118-119
  • 2.5 hGH口服胶囊果蝇生存期实验结果119
  • 2.6 hGH口服胶囊NIH小鼠和SD大鼠急性毒性试验结果119
  • 2.7 hGH口服胶囊SD大鼠长期毒性试验结果119-123
  • 3.结论123-125
  • 参考文献125-127
  • 致谢127
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    【参考文献】

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    1 侯松旺,陈新文,王汉中,胡志红;一种以PCR产物直接构建同源重组杆状病毒的方法[J];中国科学C辑;2003年02期

    2 曹翠平,吴小锋;重组昆虫杆状病毒构建和筛选技术进展[J];昆虫学报;2004年06期

    3 林瑛,陈婉蓉,季永镛,孙兵;小鼠IL-12受体β2胞内区蛋白表达及多抗制备[J];上海免疫学杂志;2003年05期

    4 耿朝晖,郜鹏,刘莹,赵东明,张宝珠,俞新大,李建民;用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达人生长激素[J];中国生物化学与分子生物学报;2002年01期

    5 陈蓓,朱威;人生长激素研究进展[J];生物学杂志;2004年01期

    6 邓小昭,朱应,刁振宇,齐义鹏,周宗安;一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建[J];微生物学报;2000年02期

    【共引文献】

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    1 崔林开;叶华智;;3种ELISA法检测Bt杀虫蛋白的比较研究[J];安徽农业科学;2005年11期

    2 王自良;张海棠;王艳荣;张改平;;氯霉素人工免疫原的合成与鉴定[J];安徽农业科学;2006年09期

    3 吴晓英,李萃,肖志强,李建玲,冯雪萍,易红,李茂玉,陈主初;人支气管上皮组织癌变各阶段2-DE图谱及差异分析[J];癌症;2004年05期

    4 李荣,刘晓力,杜庆锋,张嵩,周淑芸;双向凝胶电泳分析三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡[J];癌症;2004年10期

    5 李芳,朱怀仕,韩志强,陈刚,高庆蕾,贾平,张阿丽,奚玲,徐茜,廖国宁,王世宣,卢运萍,马丁;趋化因子受体及配体在卵巢癌细胞迁移中的作用[J];癌症;2005年01期

    6 占剑锋,黄涛;矿物质元素在银杏中的分布及其研究[J];安庆师范学院学报(自然科学版);2005年02期

    7 王晓俭;两种不同制备酶标记结合物方法的比较[J];青岛大学医学院学报;2003年01期

    8 虞伟,廖建辉,葛存旺,顾宁,武建国;胶体金纳米粒子及其蛋白标记物在电场中的泳动行为研究[J];微纳电子技术;2003年09期

    9 刘建,彭东信,刘晓晴,朱朝霞,车东媛,赵时宇;双黄连对肺炎支原体感染大鼠肺组织中PDGF-BB影响的免疫组织化学研究[J];浙江中医学院学报;2001年01期

    10 程立均,康现江,穆淑梅,郭明申,赵晓瑜;中华绒螯蟹精荚分级分离及其蛋白组分分析[J];动物学杂志;2005年05期

    中国重要会议论文全文数据库 前9条

    1 徐冬云;江仲文;;红曲霉谷氨酸脱羧酶的性质研究[A];2007年学术年会论文集[C];2007年

    2 单彩云;刘春燕;姜振峰;邱红梅;单大鹏;张大伟;胡国华;陈庆山;;温度对黑龙江大豆主栽品种球蛋白的影响[A];中国作物学会2007年全国作物遗传育种学术研讨会论文集[C];2007年

    3 李俊玲;王世立;韩金祥;王国栋;孙杰;;重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的复性[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年

    4 郭陈会;;N~+离子束注入对玉米POD和SOD同工酶的影响[A];中国科协2005年学术年会“新疆现代农业论坛”论文专集[C];2005年

    5 张慧;班立丽;顾胜华;杨兵兵;罗敏;韩宏昇;李玛琳;;云南白药含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年

    6 吴小锋;曹翠平;鲁兴萌;;利用细菌转座子构建适用于家蚕的快速杆状病毒基因表达系统[A];中国蚕学会第七届二次理事会暨学术年会论文集[C];2005年

    7 杨灵;刘国生;沈桂芳;张志芳;;Geobacillus POT-5高温淀粉酶α-amylase基因的克隆及表达[A];2006中国科协年会论文集(第13分会场)[C];2006年

    8 黄遂柱;戴克戎;汤亭亭;;生长激素治疗绝经后骨质疏松症的实验研究[A];全国老年骨质疏松专题学术研讨会论文汇编[C];2000年

    9 刘济宁;刘贤进;余向阳;彭正强;;海洋细菌JAAS01D杀虫蛋白初步分离纯化及特性分析[A];农药与环境安全国际会议论文集[C];2005年

    中国博士学位论文全文数据库 前10条

    1 张焱如;马生长激素(GH)基因序列、分子进化及其多态性的研究[D];内蒙古农业大学;2005年

    2 刘阳;小鼠睾丸足细胞体外诱导成熟T淋巴细胞凋亡及其机理的实验研究[D];第二军医大学;2000年

    3 吴建春;青藤碱对移植物抗宿主病的防治作用及免疫学机理研究[D];第一军医大学;2000年

    4 寇志华;钩端螺旋体保守性抗原与疫苗研究[D];第二军医大学;2001年

    5 唐玲;银屑病患者朗格汉斯细胞异常机制的研究[D];第二军医大学;2001年

    6 覃林花;趋化因子与共刺激分子联合基因治疗肝癌的实验研究[D];第二军医大学;2001年

    7 柯重伟;四环素调控系统控制白喉毒素-血管内皮生长因子融合基因治疗胃癌的基因研究[D];第二军医大学;2001年

    8 杨传标;连黛胶囊治疗胃肠肿瘤临床疗效观察与分子机理研究[D];广州中医药大学;2001年

    9 刘振华;基于树突状细胞途径的多发性骨髓瘤CTLs诱导及其免疫生物学特征研究[D];第一军医大学;2001年

    10 乔传玲;表达禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D];中国农业科学院;2001年

    中国硕士学位论文全文数据库 前10条

    1 刘红军;人胎盘组织cDNA文库的构建及人生长激素cDNA的克隆[D];西北农林科技大学;2007年

    2 朱振洪;人内皮抑素在家蚕培养细胞和幼虫中表达的研究[D];浙江大学;2001年

    3 陈寅;appA植酸酶基因与纳豆激酶基因的克隆与表达研究[D];中国农业科学院;2003年

    4 柏林;sVEGF在肝癌诊断中的应用价值及RF治疗术后变化的实验研究[D];第一军医大学;2000年

    5 梁雄;广西地区肝癌高发家族HLA-A2与HCC的相关性研究[D];广西医科大学;2001年

    6 袁振刚;多发性骨髓瘤患者树突状细胞介导的特异性抗瘤活性的体外诱导[D];第二军医大学;2001年

    7 许卫东;抗人血小板第4因子单克隆抗体(SZ-95)的研制及其应用研究[D];苏州大学;2001年

    8 王万山;FMMU白化豚鼠免疫学特性及作为感染性疾病模型的研究[D];第一军医大学;2001年

    9 刘真喜;重组hIGF-I工程菌的发酵及产物纯化的研究[D];第一军医大学;2001年

    10 郑峰;重组人诱导型一氧化氮合酶在V_79细胞中的稳定表达及其对平滑肌细胞增殖的影响[D];第三军医大学;2001年

    【同被引文献】

    中国期刊全文数据库 前2条

    1 陈蓓,朱威;人生长激素研究进展[J];生物学杂志;2004年01期

    2 陈登鸿,严鼎;单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素[J];中国免疫学杂志;2000年12期

    中国硕士学位论文全文数据库 前1条

    1 卢希彬;密码子优化的人生长素基因在大肠杆菌及人生长素基因在毕赤酵母中表达的研究[D];华东师范大学;2006年

    【二级参考文献】

    中国期刊全文数据库 前2条

    1 张光裕;我国棉铃虫病毒杀虫剂的研究开发和应用[J];长江流域资源与环境;1994年01期

    2 侯松旺,陈新文,王汉中,胡志红;一种以PCR产物直接构建同源重组杆状病毒的方法[J];中国科学C辑;2003年02期

    【相似文献】

    中国期刊全文数据库 前10条

    1 ;激素和活性多肽[J];生物技术通报;1987年11期

    2 石贵贤;激素的新时期[J];中国生物工程杂志;1984年02期

    3 孙国凤;;大洋渔业公司证实金枪鱼生长激素在大肠杆菌中表达[J];生物技术通报;1989年01期

    4 王颖;;宇宙航行影响生长激素的形成[J];生物技术通报;1991年04期

    5 朱遐;新发现的基因突变对人生长激素市场的扩展作用[J];生物技术通报;1996年06期

    6 陈蓓,朱威;人生长激素研究进展[J];生物学杂志;2004年01期

    7 ;激素和活性多肽[J];生物技术通报;1985年01期

    8 柯为;苏联用基因工程技术创建高产人生长激素微生物[J];中国生物工程杂志;1985年03期

    9 刘维全,殷震,龚和,齐顺章,朱宝利,涂长春,苟鸿鹰,王嫣,许丽艳,孙明;生长激素转基因家蝇的建立[J];中国兽医学报;1996年06期

    10 李兆寰;;生长激素抑制因子对人生长激素释放的抑制作用[J];国外医学.内科学分册;1975年03期

    中国重要会议论文全文数据库 前10条

    1 谢兵;陈炯;;两种人生长激素治疗Ⅱ度烧伤的成本-效果分析[A];第四届全国烧伤救治专题研讨会烧伤感染救治新进展论文汇编[C];2006年

    2 栾好江;邓洁英;史轶蘩;;干扰素-γ促进IM-9细胞内人生长激素启动子活性机制的研究[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年

    3 吴玉荣;;人生长激素(思增)在肝硬化为手术期病人中的应用[A];全国传染病护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2002年

    4 万瑜;郭艳红;王柏军;杨钢;;人生长激素R167和D171的种族特异性[A];中国生理学会、中国神经科学会2005年神经内分泌免疫学术研讨会论文摘要汇编[C];2005年

    5 万瑜;郭艳红;王柏军;杨钢;;人生长激素R167和D171的种族特异性[A];中国生理学会、中国神经科学会2005年神经内分泌免疫学术研讨会论文摘要汇编[C];2005年

    6 宋国栋;王德昌;贾军;马印东;张磊;杨涛;李绪昆;曹荣升;;重组人生长激素对烧伤大鼠肠黏膜结构及细胞凋亡的影响[A];全面建设小康社会:中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集(下)[C];2003年

    7 丁惠国;周莉;董培玲;张仁敏;林伟;张斌;金瑞;赵春惠;王慧芬;徐瑞平;;GH-IGFs轴与肝脏疾病及rhGH在重型肝炎中的治疗作用[A];第二届全国人工肝及血液净化学术年会论文集[C];2005年

    8 李云宝;戴信兰;孙燮钧;姚曾序;;C-4工程细胞的无血清培养[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年

    9 张雨;施世明;陈雪莲;吴婷;杨帆;刘莹;李静雯;刘媛媛;万瑜;;人生长激素与其受体的亲和力及生物效能的关系[A];中国生理学会消化内分泌生殖代谢生理专业委员会2011年消化内分泌生殖学术会议论文摘要汇编[C];2011年

    10 梁兆龙;;生长激素治疗矮身材儿童的作用评价[A];中华中医药学会学术年会——创新优秀论文集[C];2002年

    中国重要报纸全文数据库 前10条

    1 本报记者 李颖 通讯员 段文利;[N];科技日报;2005年

    2 河南省淮阳县人民医院 常怡勇;[N];大众卫生报;2005年

    3 刘扬;[N];中国医药报;2006年

    4 李欣 潘慧;[N];健康报;2006年

    5 张树庸;[N];科技日报;2003年

    6 崔翔宇;[N];中国医药报;2006年

    7 庄愉;[N];医药经济报;2001年

    8 刘淑平 王东凯 张蓓;[N];中国医药报;2006年

    9 铮奎;[N];中国医药报;2008年

    10 本报特约撰稿人 徐铮奎;[N];医药经济报;2008年

    中国博士学位论文全文数据库 前4条

    1 蓝航莲;家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究[D];浙江大学;2009年

    2 李伟;人生长激素受体拮抗剂对STZ诱发的大鼠糖尿病肾小球硬化的影响[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年

    3 梁道明;重组人生长激素对人胃癌裸鼠移植瘤及骨髓的影响[D];昆明医学院;2008年

    4 王峻峰;生长激素缺乏症的病因学研究[D];中国协和医科大学;1995年

    中国硕士学位论文全文数据库 前10条

    1 张昕泂;1.家蚕细胞瞬时表达人生长激素基因组DNA 2.昆虫细胞抗微生物肽启动子的诱导活性的研究[D];第二军医大学;2002年

    2 张毅;重组人生长激素对腹腔化疗大鼠骨髓影响的实验研究[D];昆明医学院;2004年

    3 梁道明;重组人生长激素在体内外对人胃癌细胞生长的影响[D];昆明医学院;2003年

    4 宋晓妍;人生长激素真核表达载体的构建及其瞬时表达[D];郑州大学;2006年

    5 扶新芝;重组人生长激素直肠栓剂的制备及其稳定性的研究[D];吉林大学;2007年

    6 刘红军;人胎盘组织cDNA文库的构建及人生长激素cDNA的克隆[D];西北农林科技大学;2007年

    7 宋向凤;人生长激素基因在小鼠体内的表达及对免疫功能的影响[D];新乡医学院;2003年

    8 张运歆;重组人生长激素对荷瘤裸鼠血清中GH、IGF-Ⅰ、IGFBP和VEGF的影响[D];昆明医学院;2008年

    9 邵波;新型促血小板生成融合蛋白体内分布与免疫原性实验研究[D];第三军医大学;2006年

    10 石文;烧伤大鼠肠粘膜细胞凋亡变化及重组人生长激素调控作用的研究[D];山东大学;2009年


      本文关键词:家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究,由笔耕文化传播整理发布。



    本文编号:108735

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