花生荚果发育初期赤霉素合成和信号传导关键基因的研究

发布时间：2017-05-01 15:12

  本文关键词：花生荚果发育初期赤霉素合成和信号传导关键基因的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：赤霉素是一种调控植物生长发育的重要植物激素，赤霉素促进植物从分生组织到茎枝生长、从幼年叶到成年叶的发育和从营养生长到开花，也影响到花的发育。这些生长发育的过程的适当调节对植物的生存和作物的生产来说是必不可少的。果实的发育与种子产量和品质以及与抗病能力密切相关，果实发育的研究具有重要的应用价值。研究赤霉素合成和信号传导对花生荚果发育的调控，可能是阐明花生荚果发育机理的最直接有效的途径。 在赤霉素的生物合成过程中GA_20氧化酶（GA_20-ox）和GA_3氧化酶（赤霉素3-β-氧化酶又称赤霉素3-β-羟化酶，GA_3-ox）在催化合成具有生物活性的赤霉素方面起着关键作用，而GA_2氧化酶则是使生物活性赤霉素失活的关键酶。GA_20氧化酶是赤霉素生物合成最重要的限速酶，在许多植物中该酶是由多基因家族编码的，家族的不同成员之间在表达上具有特异性。GA_3-ox催化GA_20形成GA1，催化GA9形成GA4。GA_3ox也是赤霉素合成过程中的关键限速酶。GID1是赤霉素受体，DELLA是赤霉素信号传导的负调控因子。在生物活性赤霉素不存在或浓度较低的情况下，，DELLA直接或间接抑制赤霉素响应基因的转录。具有生物活性的赤霉素可与GID1结合，导致GID1构象发生改变，构象改变后的GID1会与DELLA蛋白相互作用，使DELLA蛋白泛素化，从而诱导蛋白酶途径对DELLA蛋白的降解。具有生物活性的赤霉素去除了DELLA蛋白的抑制，激活赤霉素响应基因的表达，完成赤霉素对植物生长发育的调控。本研究克隆了赤霉素生物合成及信号传导过程中的关键基因，并验证了它们的功能，为研究花生荚果发育初期的赤霉素作用机制奠定了基础。 本实验主要研究结果如下： （1）通过花生果针转录组数据和RACE技术克隆基因：分析花生果针转录组数据，找到相应的unigene，设计5'RACE和3'RACE引物，通过巢式PCR克隆到AhGA_2-ox、AhGA_3-ox、AhGA_20-ox、AhDELLA、AhGID1的全长，得到它们的ORF分别为1014bp、1095bp、1128bp、1821bp、1035bp。 （2）过量表达载体的构建和烟草转化：分别构建了AhGA_2-ox、AhGA_3-ox、AhGA_20-ox、AhDELLA和AhGID1的过量表达载体pCAMBIA_2300-AhGA_2-ox，pCAMBIA_2300-AhGA_3-ox， pCAMBIA_2300-AhGA_20-ox， pCAMBIA_2300-AhGID1，通过农杆菌介导法侵染烟草叶片，经共培养、抗性筛选和生根培养等步骤获得四个基因的转基因植株。 （3）双分子荧光互补实验和酵母双杂交系统验证DELLA与GID1相互作用：分别构建了双分子荧光互补实验载体pSPYCE-AhDELLA、pSPYNE-AhGID1和酵母双杂交实验载体pGBKT7-AhGID1、pGADT7-AhDELLA。在农杆菌侵染的洋葱表皮细胞中我们检测到黄色荧光信号，初步验证了花生DELLA蛋白和GID1的相互作用。 （4） AhGA_2-ox、AhGA_3-ox、AhGA_20-ox、AhDELLA、AhGID1的表达模式分析：分析相近物种的保守序列，在非保守序列设计引物，以花生各个组织的cDNA为模板，通过荧光定量PCR，对上述基因进行表达模式分析。结果显示上述基因在花生各个组织均有表达，在各个组织中的表达量差异较大。
【关键词】：赤霉素 信号传导 荚果发育 基因表达
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：S565.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文缩略表9-10
• 第一部分 文献综述10-27
• 1 植物的荚果发育10-12
• 2 赤霉素的研究进展12-16
• 2.1 赤霉素的生物合成途径13-14
• 2.2 赤霉素生物合成途径中的关键酶和基因14-16
• 3 赤霉素的信号传导16-24
• 3.1 GA 信号通过泛素-蛋白酶体途径降解 DELLA 蛋白18-19
• 3.2 GA 信号传导的非蛋白机制19-20
• 3.3 磷酸化对 DELLA 蛋白活性的改变20-21
• 3.4 DELLA 通过多个靶蛋白调控植物的生长发育21-24
• 4 赤霉素在果实发育中的作用24-26
• 5 本实验的研究意义26-27
• 第二部分 实验论文27-70
• 1 材料与方法27-45
• 1.1 材料和试剂27-33
• 1.2 实验方法33-45
• 2 实验结果45-68
• 2.1 基因全长的克隆45-51
• 2.2 GA_2-ox，GA_3-ox，GA_(20)-ox，GID1 基因过量表达载体构建51-53
• 2.3 烟草遗传转化及转基因植株检测53-55
• 2.4 双分子荧光互补载体的构建55-57
• 2.5 双分子荧光互补结果检测57-58
• 2.6 酵母双杂证明 AhDELLA 与 AhGID1 互作58-61
• 2.7 花生 DELLA 基因的原核表达61-64
• 2.8 AhGA_2-ox、AhGA_3-ox、AhGID1、AhDELLA 的表达模式分析64-67
• 小结67-68
• 3 讨论68-70
• 参考文献70-80
• 攻读硕士期间发表文章80-81
• 致谢81

【参考文献】

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1 宋松泉,段咏新,傅家瑞;ABA对种子发育的调节[J];种子;1997年05期

  本文关键词：花生荚果发育初期赤霉素合成和信号传导关键基因的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：339159