栀子褐斑病病原菌鉴定、理化特性及生物学防治研究

发布时间：2020-04-24 16:09

【摘要】：栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实,是江西省的道地药材,性味苦寒,具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效,是临床上治疗热病心烦、黄疽尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒肿疡、扭挫伤痛等证的常用药材;在工业中,随着人工合成色素不良影响的连续报道,栀子色素作为天然色素越来越受人们的青睐,具有广阔的市场前景。栀子在全国大多数省份均有种植,褐斑病是栀子种植中常见的叶部病害,在我国发生严重,导致栀子果实产量下降,品质降低,对栀子的生长构成了严重的威胁,造成巨大的经济损失,阻碍中医药事业的快速发展。因此,对栀子褐斑病的研究显得尤为重要。本研究以栀子褐斑病原为研究对象,采用常规组织分离法对褐斑病原进行分离、鉴定,并对褐斑病菌侵染栀子叶片过程中生理生化指标的变化进行研究,弄清栀子在病害胁迫下理化指标的变化趋势,接着对栀子褐斑病菌的生防细菌展开研究。本研究旨在明确栀子褐斑病致病菌,研究植物病害状态下理化指标的变化趋势,筛选对栀子褐斑病病原具有防治作用的细菌,以期为褐斑病的生物防治提供试验基础。以典型栀子褐斑病叶片为研究对象,采用分离病原菌常用的组织分离法对褐斑病菌进行分离、纯化,按照柯赫氏法验证,确定栀子褐斑病的致病菌株,观察致病菌株显微形态特征、真菌rDNA-ITS序列结果对比分析,对病原菌进行鉴定,结果表明,从收集到的典型栀子褐斑病叶片中分离纯化得到的致病菌株在平板培养皿中培养观察,初期有白色的气生绒毛状菌丝,菌落白色,随后逐渐加深呈浅褐色、深褐色,显微镜下观察菌丝白色、有分支、有隔,rDNA-ITS序列分析结果Genbank中对比分析,确定该病害病原为黑孢霉菌(Nigrospora oryzae)。将分离得到的褐斑病菌侵染健康栀子叶片,测定病原侵菌染后的0-72 h小时不同时间段内CAT、POD、SOD、PPO、PAL活性,研究栀子褐斑病侵染过程中生理生化指标的变化,其中CAT在0-6 h活性持续升高,在6 h达到活性高峰之后缓慢减低;POD在0-12 h活性持续升高,在3 h和12 h活性高峰,随后活性呈现缓慢下降趋势;SOD在0-3 h活性先降低,而后的3 h-12 h活性持续增高,在12 h达到活性高峰,随后缓慢降低;PPO在0-12 h活性不断升高,在12 h活性达到高峰之后便缓慢降低;PAL在0-12 h内活性不断升高,在12 h活性达到高峰,随后12-24 h活性迅速降低,随后小幅下降。结果表明不同酶在抵抗病原侵入时或在同一时期或不同时期发生作用,产生抗性。选用栀子根际土壤,采用土壤系列稀释法分离筛选细菌,对得到的细菌采用平板对峙法初步筛选对栀子褐斑病菌抑制作用的细菌,选有抑制作用的细菌制备发酵液,与PDA混匀后接种褐斑病菌,再次测定抑制率,最后取发酵液进行叶片防治率试验。结果表明,菌株YN-1具有较高的防治率,其防治效率高达62.50%。对其进行分子学鉴定,16S rDNA序列结果在GenBank数据库对比,确定该菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
【图文】：

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图 2-1 接种后病叶再分离之后的褐斑病菌落Figure 2-1 Brown spot colony after re-isolation of diseased leaves afterinoculation图 2-2 褐斑病菌丝形态观察（×40）Figure 2-2 MorpH ologicalobservation of brown spot（×40）3.2.2 致病性检测健康栀子叶片在接种菌块 48 h 内出现近圆形的褐色病斑，，颜色为黄褐色至淡褐色，直径 2mm 左右，随后病斑慢慢变大，病斑颜色逐渐加深至深褐色，对侵染病原菌的致病栀子叶片进行病原菌再分离，可得到相同菌落特征的病原菌。3.3 扩增及测序提取的褐斑病病原菌 DNA 和真菌通用引物进行扩增，产物电泳后在成像系统中观察在 500 bp 附近质检有一明亮条带，见图 2-3。

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图 2-1 接种后病叶再分离之后的褐斑病菌落Figure 2-1 Brown spot colony after re-isolation of diseased leaves afterinoculation图 2-2 褐斑病菌丝形态观察（×40）Figure 2-2 MorpH ologicalobservation of brown spot（×40）3.2.2 致病性检测健康栀子叶片在接种菌块 48 h 内出现近圆形的褐色病斑，颜色为黄褐色至淡褐色，直径 2mm 左右，随后病斑慢慢变大，病斑颜色逐渐加深至深褐色，对侵染病原菌的致病栀子叶片进行病原菌再分离，可得到相同菌落特征的病原菌。3.3 扩增及测序提取的褐斑病病原菌 DNA 和真菌通用引物进行扩增，产物电泳后在成像系统中观察在 500 bp 附近质检有一明亮条带，见图 2-3。
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.671

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