苜蓿斑蚜胰蛋白酶抑制剂筛选及效果评价

发布时间：2020-05-04 06:50

【摘要】：蛋白酶抑制剂是一类广泛存在于动植物和微生物体内的小分子多肽或者蛋白质,抑制蛋白水解酶的催化活性。本研究通过苜蓿接蚜差异基因组学分析,得到了不同抗性苜蓿品种差异表达的苜蓿胰蛋白酶抑制剂基因,采用基因工程等技术手段,克隆了该基因全长序列,构建了高效重组表达载体并进行了重组蛋白的纯化,利用人工饲料掺入法测定了苜蓿胰蛋白酶抑制剂对苜蓿斑蚜虫生长和发育的影响,研究了对苜蓿斑蚜体内主要蛋白酶活性的抑制作用,结果表明重组蛋白对苜蓿斑蚜具有很好的抑制作用,明显的抑制了苜蓿斑蚜体内蛋白酶的活性并导致死亡。本研究取得了如下研究结论:进行了苜蓿接蚜转录组测序分析,筛选到了差异表达的6个苜蓿胰蛋白酶抑制剂基因,实时荧光定量PCR验证后,NCBI比对,设计了两条寡核苷酸引物,以苜蓿叶总基因组c DNA为模板,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到长度约为657 bp和612 bp的大小的两个Kunnitz型胰蛋白酶抑制基因,筛选出阳性转化子,菌液PCR验证该基因片段为所需目的基因全长片段,命名Msti-95(Medicago sativa trypsin inhibitor 95)和Msti-16(Medicago sativa trypsin inhibitor 16)。设计合成两条5’端含有限制性内切酶Bam HI和3’端含有Xho I酶切位点的寡核苷酸引物,进行PCR扩增获得目的片段,大肠杆菌转化后得到重组质粒p T-Msti-95和p T-Msti-16,将获得的目的片段和原核表达载体p SYno-1同时采用Bam HI和Xho I双酶切,接下来利用T4 DNA连接酶构建表达载体,提取阳性菌落质粒,经双酶切鉴定和测序分析确定Msti-95和Msti-16基因均已成功插入到表达载体中,构建重组表达载体p S-Msti-95和p S-Msti-16。IPTG诱导,获取最佳表达条件,使目的基因获得高效的表达;SDS-PAGE电泳检测,结果表明目的基因有高效表达,接下来采用镍(Ni-NTA)柱,以含有咪唑的Wash buffer上样,洗脱,经蛋白电泳检测后获得纯度较高的表达蛋白。采用饲喂法测定了蛋白抑制剂Msti-95和Msti-16表达纯化蛋白对苜蓿斑蚜存活、繁殖的影响。结果表明,纯化蛋白具胃毒活性,抑制苜蓿斑蚜生长发育。苜蓿斑蚜取食含浓度为800μg/m L的Msti-95和Msti-16表达纯化蛋白混合纯人工饲料的存活率分别为21.7%(P=0.04)和18.3%(P=0.03),两者均显著低于对照组60.0%的存活率;繁殖率分别为186.7%(P=0.04)和198.3%(P=0.05),两者均显著性低于对照组315.0%的繁殖率。Elisa酶联免疫吸附测定了对虫体内蛋白酶活性的影响,结果表明取食含浓度为800μg/m L的纯化蛋白混合纯人工饲料的苜蓿斑蚜后,苜蓿斑蚜体内总蛋白酶较对照组酶活性均显著降低(P0.05);苜蓿胰蛋白酶重组表达菌体处理浓度为5000μg/m L以上处理组苜蓿斑蚜,总蛋白酶(Pr)、氨肽(APs)酶、胰蛋白酶(Tr)、胰凝乳蛋白酶(CTP)的活性显著降低(P0.05)。
【图文】：

示意图,蚜虫,取食,次级代谢产物

植物本身具有的茎、叶、绒毛、蜡质、细胞壁组成等（Paiva et al., 2000）。后是形成了诱导型防御机制，是由于外界刺激后引起的连锁反应，诱导型防御一般来说是具有起着主导作用的地位（Maleck et al., 1999）。如图1.1（引自Zust T & Agrawal A A. Natureplants,2016, doi: 1038/NPLANTS. 2015. 206）所示，以蚜虫为代表性的刺吸式口器昆虫取食植物汁液与植物启动防御反应示意图。图 1. 1 蚜虫取食与植物防御反应示意图1：蚜虫刺吸式口器刺透植物体壁；2：分泌唾液包裹口针；3：口针在韧皮部吸食汁液或分泌唾液包裹效应子蛋白；4：被破坏的植物韧皮部开始愈合；5：植物体合成防御次级代谢产物；6：次级代谢产物在韧皮部运输；7：次级代谢产物在蚜虫肠道或血淋巴中被消化和吸收；8：次级代谢产物在血淋巴中积累或通过后肠被排出体外；9：次级代谢产物被消解并随蚜虫蜜露排除体内。Fig. 1.1 A schematic of aphid feeding and plant responses.1: Piercing the wall of plants by aphid spiny mouthparts; 2: Package needle by secreting salivary; 3: The mouth needlesucks juice or secretes saliva effector protein in phloem; 4: The damaged phloem begins to heal; 5: Plant synthetic thesecondary metabolites; 6: Secondary metabolites transport in phloemare; 7: Secondary metabolites are digested and absorbedin the intestinal tract or hemolymph of aphids; 8: Secondary metabolites are accumulated in the hemolymph or excretedthrough the hindgut; 9: Secondary metabolites were eliminated and eliminated with aphid honeydew.1.3.2 苜蓿虫害与苜蓿斑蚜的防治研究紫花苜蓿（Medicago sativa），豆科植物（Leguminosae）

流程图,测序,流程,离心管

L CHCl3萃取，振荡均匀，，室in；换离心管，滴入等倍体积的in；in，弃滤液；水 C H O，12000 r/min 高速离2~3 min；加入50 μL 65℃预热的无核酸NA；；物电泳检测再次确认提取质库构建，主要流程有总RNA段选择和PCR富集，文库质量
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ453

【参考文献】