HrpZm抗大豆疫霉根腐病功能解析及新种质创制

发布时间：2020-05-04 09:17

【摘要】：hrp基因是病原物与植物互作过程中,能够在非寄主植物上引起过敏性发应,而在寄主植物致病的一类基因。hrp基因的编码蛋白为Harpin,是一类富含甘氨酸、对热稳定、对蛋白酶K敏感的蛋白,它的一个重要功能是诱导激发植物体产生防卫反应,提高植物的抗病虫和抗逆能力,并促进植物生长、产量和品质的提升。转hrp基因的植物由于外源基因的整合可以大幅度的提高作物抗病虫及其它逆境能力。植物应对胁迫表现为一系列基因和基因产物的特异表达性,植物表达抗病反应的过程也是抗病信号传递的过程。大豆(Glycine max)富含优质食用油脂、植物蛋白和对人体有益的多种生理活性物质,是世界上重要的油料作物、粮食作物、饲料作物、蔬菜作物和经济作物。大豆疫霉根腐病(Phytophthora sojae)是大豆生产上的毁灭性病害之一,在大豆生产上属世界性病害,由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae M.J.Kauf-mannJ.W.Gerdemann)侵染引起。目前,防治该病最为有效的手段是选用抗病品种。但由于大豆疫霉菌毒力结构复杂、生理小种遗传变异速度快,而常规育种技术周期长,工作量较大,缺乏抗性资源,难以满足生产的需要。随着hrp基因作用机制的深入研究以及植物基因工程技术的逐渐成熟,利用抗病基因工程育种成为解决大豆抗疫霉根腐病难题的有效途径之一。hrpZpsta基因来源于烟草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Psta218菌株,是hrp基因家族中的一员。本研究以常用的大豆模式材料(Jack,Williams 82)及大豆生产品种沈农9号、华春6号等作为转基因受体。为确保hrpZpsta基因在受体中的正常表达,根据大豆基因组密码子的偏好性,将hrpZpsta基因优化并命名为hrpZm。以hrpZm为目标基因,以草丁膦作为筛选标记构建表达载体,采用根癌农杆菌介导法将hrpZm基因转入到受体品种中。通过对连续多代的转基因后代材料抗大豆疫霉根腐病的生物学功能鉴定、HrpZm蛋白功能解析和遗传稳定性筛选,获得对大豆疫霉根腐病具有较高抗性的新种质材料HP116。以HP116及对应受体为实验材料,对其抗病反应、抗病基因表达及抗病生理活性物质合成量进行比较研究,为研究hrpZm基因通过激发多条抗病信号途径提高植物抗病性的作用机理提供了新的证据。本研究主要结果如下:1、本研究根据大豆密码子偏爱性,将hrpZpsta基因进行人工优化合成,优化后的hrpZm基因长度为423bp,与原基因序列有73.52%的相似度,GC含量为47.8%,构建到植物表达载体pTF101-Gmubi3中,构建了植物重组表达载体pTF101-Gmubi3-hrpZm。2、将重组表达载体pTF101-Gmubi3-hrpZm转化到农杆菌感受态细胞EHA101中。以大豆的子叶节为外植体,采用农杆菌介导法转化大豆,将目的基因hrpZm导入到受体材料中。本研究中,受体Jack、Williams82、华春6号、沈农9号的转化率分别为5.06%,4.24%,1.24%,1.82%,遗传转化的平均转化率为2.48%。共获得再生苗679株,其中受体为Jack的147株,受体为华春6号的的192株,受体为Williams 82的134株,受体为沈农9号的206株。3、种植T_0代收获的种子于温室中,单株采用与T_0代相同的鉴定方法,同一株系的种子混合收获,T_1代入选转基因群体27个。从T_2代开始,对来自于不同转基因事件的连续多代的转基因后代群体进行抗大豆疫霉根腐病的生物学功能鉴定,解析了HrpZm的生物学功能。在不同世代中综合考量PCR检测,Southern杂交,RT-PCR检测,Western杂交分析,ELISA分析及Real time-PCR等多项检测分析的结果,筛选到来自于转基因事件B4J9116的后代株系B4J9116-6-2-4,该株系T_2-T_3代的多个单株Southern杂交检测结果均显示单一条带,T_3-T_5代PCR检测阳性率均为100%,T_3代RT-PCR检测和Western杂交结果均显示阳性,T_3代叶片中基因表达量、T_4代不同采样部位基因表达量的Real time-PCR检测分析目标基因均表现出较高的基因表达量,T_4代单株靶标蛋白ELISA特异性测定HrpZm和PAT蛋白均表现出了较高的检出率,T_5代对大豆疫霉根腐病的抗性,出苗,结实等性状均表现优异,田间种植农艺性状与受体无明显差异,将株系定名为HP116。4、以HP116为实验材料,采用Real time-PCR技术测定了R基因抗性、细胞程序性死亡、水杨酸、茉莉酸等多条信号途径关键基因表达量,其中水杨酸信号途径关键基因PR1、PR12、PAL在大豆疫霉根腐病为害的大豆植株的叶片上基因表达量均表现出明显的上调。茉莉酸信号途径基因AOS基因表达量在叶片上微弱上调,而PPO却明显的上调。细胞程序性死亡GmNPR1和GmNPR2明显上调,而与R基因抗性相关的基因GmSGT1基因表达量微弱上调,RAR基因表达量明显的上调。基因的相对表达量检测结果表明,转hrpZm基因大豆株系中对大豆疫霉根腐病的抗性是多种调控机制共同作用的结果,多条抗病途径的协同交互作用实现了该过程。转基因种质HP116由于外源基因的导入其对病原菌的伤害与受体相比表现出了不同的防御机制。在抵抗大豆疫霉根腐病的侵染时RAR、GmSTG1、GmNPR1、GmNPR2、PAL、PR1、PR12、PPO等基因均起到了重要的作用。5、在病原菌侵染前,HP116幼苗叶片中各防御酶的活性除PAL外均较受体高,在被大豆疫霉根腐病病原菌侵染的过程中,PAL、POD、PPO及SOD酶活性均呈上升的趋势,其中PAL、PPO两种酶活性迅速升高,同时启动水杨酸信号途径和茉莉酸信号途径,两个途径协同作用抵抗病原菌的入侵。虽然不同的酶变化趋势及峰值出现的时间和频率略有不同,但活性显著高于受体,表明hrpZm基因在受体基因组中的整合提高了受体品种的抗病性和对病原菌侵染的反应、抵抗能力。本研究利用优化后的hrpZm基因转化获得对大豆疫霉根腐病抗性升高的转基因新种质。hrpZm基因在受体基因组中的整合影响和调控了受体原有的抗病代谢途径,激活了R基因抗性、细胞程序性死亡、水杨酸、茉莉酸等多条信号途径,使得大豆抗病性性状得到改良,为大豆抗疫霉根腐病育种奠定了基础。
【图文】：

转基因农作物,种植面积,全球,公顷

. 1 2006-2017 全球转基因农作物种植面积变化趋势（igure 1.1 Worldwide production of trangenic crop from 2006 ps://www.qianzhan.com/analyst/detail/220/180913-27ef70际贸易的全球化，目前我国的大豆产业已经完全市场大大豆生产国，但同时也是世界上最大的大豆进口国我国的大豆完全自给，曾是一个净出口国。1996 年

氨基酸序列,基因序列,基因,大豆

2.4 结果与分析2.4.1 hrpZpsta 基因的优化大豆多聚泛肽启动子在大豆中具有较强的启动效率[179]，根据大豆密码子爱性，将来源于烟草野火病病原菌 P.syringae pv. tabaci Psta218的hrpZpsta 基进行人工优化合成并命名为 hrpZm。hrpZm 基因与 hrpZpsta 基因比对结果如2.1所示。优化后的 hrpZm 基因两端分别添加 XbaI/SacI 双酶切位点，以实现期验证的 XbaI/SacI 双酶切。hrpZm 基因长度为423 bp，与原序列相似度73.52%，GC含量为47.8%。分别将hrpZm基因与hrpZpsta基因进行氨基酸序列译，并对翻译后的氨基酸序列进行比对，，如图2.2所示，有7个氨基酸位点发生改变。本研究未对改造后基因翻译得到的氨基酸序列进行深入的分析，不明确折叠后是否会发生空间结构和功能的改变或丧失。改造后的hrpZm基因在稳定入大豆后能否行使预想的蛋白质功能，通过后期的生物学功能鉴定予以证明。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.651

【参考文献】