芽孢杆菌BU108的抗菌性质分析及其对马铃薯疮痂病的防治

发布时间：2020-05-11 21:08

【摘要】：近年来,我国马铃薯疮痂病发生呈现严重趋势,而长期化学农药的使用不仅对环境及人类造成伤害,同时也会造成土壤菌群失调,导致疮痂病害愈发严重。针对以上问题,本研究分离鉴定了一株对疮痂链霉菌具有显著抑制效果的生防菌株,并分析其活性蛋白性质,通过分离纯化和质谱测序鉴定了活性蛋白。随后对该菌株的最佳活性培养条件进行了优化,并通过盆栽试验和田间试验对其实际防治效果进行了检测,具体结果如下:从马铃薯疮痂病发病严重区域收集土壤,利用稀释涂布法、平板划线法和管碟法分离筛选到了一株对疮痂链霉菌具有明显抑制作用的拮抗菌株,通过16S r DNA序列比对鉴定为芽孢杆菌,并命名为BU108。通过硫酸铵沉淀法提取菌液上清后发现蛋白质组分具有抗菌活性。对活性蛋白的稳定性分析结果显示:抗菌蛋白在温度为100℃时加热5 min后失去抗菌活性,在0.5 mg/m L胃蛋白酶及胰蛋白酶处理下失去抗菌活性,在p H中性条件下具有抗菌活性,对有机溶剂及金属离子不敏感,对Tween-80较为敏感。使用阴离子交换柱对蛋白活性成分进行了分离和纯化,对得到的三个蛋白条带进行质谱测序,发现都属于γ-谷氨酰转肽酶(Gamma Glutamyl transpeptidase,GGT)的不同降解片段。经检测,GGT全长蛋白的重组表达产物并不具备抗菌效果。而通过设计和合成抗菌肽发现降解后的片段则具有一定的抗菌活性,由此可以推断GGT在培养过程中的降解产物对疮痂链霉菌起到了抑制作用。采用单因素多水平试验设计方法对菌株的抗菌活性进行了优化,确定了单因素最佳水平。通过PB试验确认碳源和氮源的质量比(C/N)、Na Cl含量和培养时间为最主要三个影响因素,随后使用响应面分析法优化确认C/N为1:2.5、Na Cl含量0.75%、培养时间23 h,为最佳培养条件。盆栽试验设置BU108芽孢杆菌3组不同浓度的处理,分别为病原菌、BU108(低)、BU108(高),结果显示,施用浓度为BU108(高)时效果最好,抑制率为90.00%,达到显著性差异。田间试验设置3组不同浓度的处理,分别为病原菌、BU108(低)、BU108(高),结果显示,施用浓度为BU108(高)时,抑制率为88.57%,达到显著性差异。由盆栽和田间试验可知BU108芽孢杆菌能够抑制马铃薯疮痂病的发生。本研究分离到一株防效显著的芽孢杆菌,分析了菌株抗菌物质的稳定性,明确了抗菌物质,进一步分析发现GGT的降解片段具有抗菌活性,确定了最佳培养条件,并经盆栽试验及田间试验验证具有良好的防病效果。本研究不仅为马铃薯疮痂病的生物防治提供了菌株材料,也为芽孢杆菌BU108的实际应用进行了探索并积累了经验。
【图文】：

碱基序列,疮痂,链霉菌

筛选、鉴定续 8 年种植马铃薯的地块采集马铃薯0 余株菌株，按排列顺序依次命名为对所有得到的菌株进行抗菌试验，结果菌效果最为明显（图 3-1）。BU108 菌皱起；在液体培养基中色暗、皱褶、链霉菌有抗菌效果。过夜培养目的菌送交上海生工完成测序。在 16S rDN的菌株相似度最为接近的碱基序列，，系统进化树。从进化树中（图 3-2）分is DV1-F-3(JH600273)亲缘关系最近，

序列,系统进化树,疮痂,菌株

图 3-2 BU108 的 16S rDNA 序列系统进化树Fig.3-2 The phylogenetic tree of BU108 16S rDNA3.2 抗菌蛋白的性质分析3.2.1 抗菌蛋白粗提取BU108 菌株具有抑制疮痂链霉菌活性，这种抗菌作用是否由菌株所产生的蛋白引起，为此设计了菌株蛋白粗提液抗菌试验。培养拮抗菌，离心收集菌液上清，在上清液中加入硫酸铵至 80%，得到蛋白沉淀和菌液上清。分离到的蛋白沉淀分别加入涂有疮痂链霉菌平板上的牛津杯中，蛋白组分有抗菌圈出现，CK(低盐缓冲液)组分没有抗菌圈出现（图 3-3）。抗菌圈明显表明具有抗菌活性，说明菌株蛋白质组分有抗菌活性。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.32;S476.1

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