D基因组野生棉响应大丽轮枝菌侵染的转录组分析

发布时间：2020-07-25 18:00

【摘要】：棉花黄萎病(Verticillium wilt)是一种通过土壤和种子传播的维管束真菌病害,致病菌(Pathogenic bacteria)多数为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。黄萎病严重影响棉花的产量和纤维品质,给棉花产业带来巨大威胁,培育优质高抗黄萎病的棉花品种是控制黄萎病蔓延的有效方式之一。经过长期的人工定向选择,栽培棉种的农艺性状与经济性状不断优化,但遗传基础狭窄、缺乏新的优良基因成为限制抗病育种取得进展的重要原因。野生棉生长环境恶劣、多有病虫害发生并与栽培棉种形成生殖隔离。前期研究证实多种野生棉具有优异的抗病性状,因此挖掘野生棉中抵御黄萎病的潜在基因资源具有重要的理论和应用价值。本研究对D基因组棉种雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D_5)、三裂棉(G.trilobum,D_8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D_1)进行了室内苗期黄萎病的抗性鉴定,随后获得0h(对照)、12h和48h大丽轮枝菌侵染3个棉种的根、茎、叶材料,共构建81个文库并进行转录组测序,为挖掘D基因组野生棉中的抗病基因奠定基础。主要研究结果如下:1.雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉的室内苗期黄萎病抗性鉴定:3个棉种抗性差异明显,接菌25天后,瑟伯氏棉达到抗病水平,雷蒙德氏棉与三裂棉感病。解剖病菌处理25天后的棉株茎段,雷蒙德氏棉维管束严重褐化。观察3个棉种使用带绿色荧光蛋白(GFP)标记的大丽轮枝菌侵染3h、6h和12h的根尖压片,发现瑟伯氏棉根尖的菌丝生物量和生长受到极大限制。综上,3个棉种的黄萎病抗性由强到弱分别是瑟伯氏棉、三裂棉和雷蒙德氏棉。2.野生棉材料响应大丽轮枝菌早期侵染的转录组分析:通过Illumina Hiseq~(TM)4000平台对病菌处理0h(对照)、12h和48h的3个棉种的根、茎、叶材料进行转录组测序。以雷蒙德氏棉基因组序列为参考进行比对,获得37223个基因。差异表达基因(DEGs)的聚类分析显示,瑟伯氏棉叶中的DEGs数量最多,三裂棉和瑟伯氏棉根和茎中的DEGs比雷蒙德氏棉多,表明抗病棉种能诱导更多基因表达。GO功能富集分析发现DEGs显著富集在氧化还原过程(oxidation-reduction process),说明病菌侵染激活了棉株的抗氧化系统。KEGG功能富集分析DEGs显著富集在碳水化合物代谢通路(carbohydrate metabolism),表明植物免疫应激反应需要大量能量。3.D基因组ABC(ATP-binding cassette)基因家族的鉴定与分析:转录组KEGG分析中膜转运通路(membrane transport)66%的DEGs为ABC基因家族成员,推测ABC基因参与野生棉的黄萎病抗性调控。从雷蒙德氏棉基因组中鉴定到166个ABC基因,其中165个随机分布在13条染色体上,1个定位于Scaffold。转录组中检测到96.4%ABC基因。ABC基因拥有多样的理化性质,亲水性平均系数(GRAVY)均小于1。通过亚细胞定位预测,141个ABC基因编码的蛋白质定位于质膜。结合转录组基因表达水平与系统发育分析,从160个基因中筛选出44个基因进行qRT-PCR验证,发现基因表达水平与3个棉种的抗性一致。进一步结合转录组表达水平及qRT-PCR筛选出抗病候选基因Gorai.007G244600,将相似性达99.71%的陆地棉同源基因Gh_D11G3432沉默。大丽轮枝菌处理后表型及生理生化指标测定发现该抗病候选基因在棉花抵御黄萎病中有一定作用。4.D基因组Bet v 1基因家族的鉴定与分析:通过功能域PF00407,在雷蒙德氏棉中鉴定出59个Bet v 1基因,除4个基因定位于scaffold外,其余55个Bet v 1基因分布在二倍体(D_5)棉花基因组13条染色体中的8条。理化性质分析显示Bet v 1氨基酸序列长度变化范围较小,多数Bet v 1蛋白为亲水性蛋白。系统发育分析表明Bet v 1蛋白质高度保守。RNA-seq结合qRT-PCR发现三个棉种的Bet v 1基因的表达模式与三个棉种的抗感性相符。从D基因组Bet v 1中筛选出一个抗病候选基因Gorai.012G129000(BETV1-54),运用VIGS技术沉默陆地棉中相似性达99.58%的同源基因Gh_D04G1399,表型及病情指数显示该基因在棉花抗黄萎病中发挥功能。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.621.2
【图文】：

氨基酸序列,生物体,植物,模体

图 1.1 ABC 转运蛋白存在于所有生物体中，尤其是植物中（Jae-UngHwang et al.,201gure 1.1 ABC transporters are present in all organisms, especially in plants (Jae-Ung Hwang et aBC 转运蛋白的结构BC 转运蛋白的结构体系独特，包含多个结构域。在分子生物学中，其功能相适应。典型的 ABC 转运由两个区域组成：嵌入双层膜中的MD）和嵌于细胞膜而向细胞质突出的核苷酸结合结构域（NBD）[3每个 TMD 由 6 个 α 螺旋构成，为底物分子运输提供通道；核苷酸结提供能量（图 1.2）。每个 NBD 内有 200 个氨基酸序列构成的保守结 A 模体和 Walker B 模体。这两个模体被 120 个氨基酸隔开。Walke B 模体中间含有 ABC 特征模体（LSSGQ）、D 环、H 环和 Q 环[36]。大约 200 个氨基酸残基）能结合和水解 ATP，从而在大量生物过程中TP 水解[29]。除这四个结构域之外，还能发现一些元素与可能起调节作合在一起[35]。根据结构域数量和排序方向将 ABC 转运蛋白被分成运子，一条独立肽链含有两个“NBD-TMD”，排序为 TMD-NBD-T

模型图,模型,亚族,抗原合成

图 1.2ABC 蛋白转运催化机制的模型（MichalJasinski，2003）ure 1.2 Model of ABC protein transport catalytic mechanism (Michal Jasin家族的分类命名系统中，根据系统发育途径和结构特征将 ABC ）。ABCB、ABCC 和 ABCG 亚族的分析最为广泛[37白，涵盖 ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、AOH）、ABCB（MDR）、ABCC（MRP）、ABCD（转运子，在跨膜转运中起到重要作用。ABCE/F 亚家功能，部分基因与调控蛋白合成有关[31]。其它全部为CA 亚族在植物中的研究较少，在脊椎动物中主要负B 亚家族成员广泛存在于真核细胞中，与线粒体多肽/铁簇蛋白的产生、抗原合成和多效耐药性等过程相关和次生代谢物的运输[38, 42]。ABCC 亚家族部分成员与物和糖基化轭合物转运相关[36]。已发现的 ABCC 亚

大丽轮枝菌,表型性状,病情指数,真叶

3.1 大丽轮枝菌侵染雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉和三裂棉的表型分析本研究首先对雷蒙德氏棉，三裂棉和瑟伯氏棉 3 个 D 基因组野生棉进行了室内黄萎病抗性鉴定，实验重复三次以上获得相似结果。在强致病性大丽轮枝菌系处理 25 天后，3 个棉种出现了明显的表型差异（图 3.1）。雷蒙德氏棉超过 50%的棉株生长点死亡，三裂棉枯死 10%，瑟伯氏棉只有 1~2 株枯死。雷蒙德氏棉大部分真叶黄化掉落，叶脉颜色明显加深，有些能看到清晰的红褐色脉络，子叶干瘪皱缩，茎段从土面以上能看到不同程度的褐化。三裂棉的发病症状比雷蒙德氏棉轻，茎秆上保留部分真叶。瑟伯氏棉的发病程度最轻，真叶的黄化和掉落最少，部分棉株没有明显发病症状。通过比较 3 个棉种大丽轮枝菌处理后 25 天的病情指数发现瑟伯氏棉能达到抗病水平；三裂棉病情指数偏高，但死亡率低；雷蒙德氏棉达到高感病水平（图 3.2）。抗性对照亚洲棉和感病对照戴维逊氏棉的病情指数分别为 17.50 和 50.00，抗感之间差异明显，说明该方法具有较好的筛选性。

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