禾谷镰刀菌烯酰基辅酶A水合酶的功能研究

发布时间：2021-02-05 19:33

　　禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是小麦赤霉病主要的致病真菌,寄主范围主要是禾谷类作物。镰刀菌侵染会使产量和品质下降,残留的真菌毒素如玉米赤霉烯酮类（Zearalenone,ZEN）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivallenol,DON）严重危害健康。同时,DON也是重要的致病因子,在小麦的侵染与致病中发挥重要作用。烯酰基辅酶A水合酶（enoyl-CoA hydratase,Ech1）能够降解脂肪酸,是脂肪酸β-氧化的重要过程。但是,在植物病原真菌中了解甚少。为此,我们对禾谷镰刀菌FgEch1进行了研究。采用生物信息学的方法在禾谷镰刀菌基因组中得到一个FgEch1基因。利用Split-marker的方法构建禾谷镰刀菌FgEch1基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化法获得FgEch1基因敲除突变体?Ech1和回复菌株?Ech1-C。分析FgEch1基因敲除突变体的相关表型变化,阐明FgEch1在禾谷镰刀菌中的功能。突变体具有下列的特征:1)突变体?Ech1对菌落生长没有影响。2)突变体影响短链脂肪酸的利用。在含正丁酸和正己酸的MM培养基上相对生长速率分别下... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 小麦赤霉病研究进展
        1.1.1 小麦赤霉病概况
        1.1.2 禾谷镰刀菌的生物学特性
        1.1.3 禾谷镰刀菌致病基因的研究进展
        1.1.4 小麦赤霉病防治措施
    1.2 脂肪酸β-氧化与烯酰辅酶A水合酶
        1.2.1 脂肪酸运输与β-氧化
        1.2.2 过氧化物酶体β-氧化
        1.2.3 烯脂酰CoA水合酶
        1.2.4 真菌烯脂酰CoA水合酶研究现状
    1.3 该项研究目的和意义
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株和载体
        2.1.2 主要溶液配制配方
        2.1.3 培养基配制方法
    2.2 实验方法
        2.2.1 禾谷镰刀菌FgEch1基因结构分析
        2.2.2 禾谷镰刀菌的保存和培养
        2.2.3 提取禾谷镰刀菌基因组DNA
        2.2.4 酵母和大肠杆菌质粒DNA提取方法
        2.2.5 普通PCR扩增反应
        2.2.6 PCR产物纯化和DNA琼脂糖凝胶胶回收
        2.2.7 构建禾谷镰刀菌FgEch1基因敲除载体
        2.2.8 原生质体制备和转化
        2.2.9 PCR验证敲除转化子
        2.2.10 Southernblot验证敲除转化子
        2.2.11 禾谷镰刀菌FgEch1基因回复
            2.2.11.1 构建FgEch1基因回复载体
            2.2.11.2 获取FgEch1基因回复菌株
        2.2.12 从生物学表型分析FgEch1基因敲除突变体
            2.2.12.1 观察菌落形态与测量菌落生长速度
            2.2.12.2 观察菌落的菌丝末端分支
            2.2.12.3 测定菌落对脂肪酸利用情况
            2.2.12.4 无性生殖测定
            2.2.12.5 测定氧胁迫下的敏感性
            2.2.12.6 测定有性生殖表型
            2.2.12.7 FgEch1突变体的致病性测定
3 结果与分析
    3.1 禾谷镰刀菌FgEch1结构和进化树分析
        3.1.1 禾谷镰刀菌FgEch1基因的获得
    3.2 禾谷镰刀菌FgEch1基因的敲除
        3.2.1 敲除载体构建过程
        3.2.2 验证敲除突变体
            3.2.2.1 PCR验证
            3.2.2.2 Southenblot验证
    3.3 获得禾谷镰刀菌FgEch1回复菌株
        3.3.1 构建FgEch1基因回复载体和回复菌株转化
        3.3.2 验证回复菌株?Ech1-C
    3.4 FgEch1基因敲除突变体的表型观察
        3.4.1 FgEch1基因不影响菌落生长
        3.4.2 FgEch1基因调控脂肪酸的利用
        3.4.3 FgEch1基因影响孢子产量与孢子萌发
        3.4.4 FgEch1基因不影响有性生殖
        3.4.5 FgEch1基因调控致病性
2O₂胁迫敏感性">        3.4.6 FgEch1基因调控对H₂O₂胁迫敏感性
4 讨论
5 总结与展望
    5.1 实验总结
    5.2 研究展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]烯酰基-辅酶A水合酶催化机理的理论研究[J]. 章瑜,杨新亚,于海瀛,马广才.  化学学报. 2017(05)
[2]山东省小麦赤霉病菌对多菌灵的敏感性测定[J]. 孙玲,张洪滨,刘秉江,徐加利,梁元存.  农药. 2013(12)
[3]2012年我国小麦赤霉病暴发原因分析及持续监控与治理对策[J]. 曾娟,姜玉英.  中国植保导刊. 2013(04)
[4]山东省小麦赤霉病菌种群组成及其致病力分化[J]. 张洪滨,柳金伟,刘秉江,刘冰,梁元存.  植物保护学报. 2013(01)
[5]线虫烯脂酰CoA水合酶的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析[J]. 李志杰,张凯,翟宇佳,周强军,耿运琪,孙飞.  生物物理学报. 2010(01)
[6]麦类赤霉病研究进展[J]. 喻大昭.  植物保护. 2009(03)
[7]“地方性乳房肿大症”病区荞麦中镰刀菌的分离和毒素测定[J]. 张永红,朱少兵,佟伟军,曹承来.  中华预防医学杂志. 1995(05)
[8]植物的甾类激素[J]. 王三根.  生命的化学(中国生物化学会通讯). 1992(02)
[9]玉米赤霉烯酮在组织培养中的生物效应(简报)[J]. 姚坤林,张帆,孟繁静.  植物生理学通讯. 1991(01)
[10]小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性测定方法的探讨[J]. 顾宝根,刘经芬.  植物保护学报. 1990(03)



本文编号：3019461